昆明10种草坪草的ISSR指纹图谱构建

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　　摘要：草坪业在发展过程中出现一些种的混淆，为了区分不同草坪草，采用昆明常见的10种草坪草为样本，利用简单重复序列（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）分子标记技术构建昆明地区常见草坪草的指纹图谱。从28条引物中筛选出15条特异性较好的引物，对其进行退火温度筛选。结果表明，引物UBC834、UBC842、UBC844退火温度分别为58、58、55 ℃时多态性较好。对引物UBC834、UBC842、UBC844的電泳图谱进行0、1读带，构建了3个草坪草的数字指纹图谱，可以将供试的10种草坪草全部区分开来。
　　关键词：草坪草;ISSR;指纹图谱;多态性
　　中图分类号：S688.401
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0073-04
　　收稿日期：2019-07-15
　　作者简介：王开拓（1992—），男，安徽淮南人，硕士研究生，主要从事植物遗传与种质资源研究。E-mail：809271790@qq.com。
　　通信作者：吴 田，博士，副教授，主要从事植物分子生物学研究，E-mail：461257271@qq.com;蓝增全，硕士，教授，主要从事生态学研究，E-mail：kmlanzengquan@qq.com。
　　近年来草坪业在我国发展迅猛，特别是在城市绿化和一些运动场中应用极为广泛，对人类赖以生存的生活环境起着保护、美化和改善作用。而昆明地处我国西南地区，气候独特，四季如春，素有“春城”的美称。陈蕴等对我国草坪草的引种工作和一些主要问题进行了综述和分析[1]。彭燕等以我国主要草坪草的研究进展为基础，提出研究和利用草坪草种质资源的对策[2]。黄鹤平等选用10个草坪草品种进行栽培研究，对昆明地区的草坪草引种进行了评价[3]。昆明市对城市的美化正在不断地加强，对草坪草的数量和质量要求也不断提高。但是，由于草坪草经修剪后通常叶色、叶宽、叶片硬度等均会发生变化，且没有花序，因此难以通过植物学性状区分草种，不利于有针对性地对草坪进行养护管理。而通过构建某一地区常见的草坪草DNA指纹图谱，为后续的草种分辨提供了途径。
　　微卫星DNA（simple sequence repeats，简称SSR）、限制性长度片段多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）等分子自标记技术均可以构建指纹图谱，它们都从不同的角度反映物种的遗传信息[4-7]。简单重复序列（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）是一种基于PCR扩增进行检测的分子标记技术，它对简单重复序列之间的区域进行多态性扩增，是由Zietkiewicz等[8]提出的。ISSR结合了其他分子标记技术的特点，如操作简单、稳定性好、多态性丰富、成本低等[9-10]，为指纹图谱的构建提供了快速可靠的技术基础。指纹图谱是品质混杂的检测工具[11]，利用ISSR分子标记技术构建指纹图谱在品种鉴定上的应用越来越广泛，前人已经在苹果[12]、桑树[13]、凤梨[14]、复烤烟[15]等多种植物材料上建立了指纹图谱。在草坪草上，刘君等利用ISSR标记技术对9份狗牙根的遗传多样性进行了研究，构建了9份材料的指纹图谱[16]。胡雪华等以上海结缕草（Zoysia japonica）JD-1和细叶结缕草（Zoysia tenuifolia）、沟叶结缕草（Zoysia matrella）、结缕草为材料，利用ISSR分子标记技术在4个材料中构建了指纹图谱[17]。本试验以昆明常见的10种草坪草为材料，利用ISSR分子标记技术构建指纹图谱，为后续从分子角度对其进行相互区分奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　本试验所用草坪草材料分别为沟叶结缕草[Zoysia matrella （L.） Merr.]、结缕草（Zoysia japonica Steud.）、细叶结缕草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）、黑麦草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata）、草地早熟禾（Poa pratensis L.）、紫羊茅（Festuca rubra L.）、细弱剪股颖（Agrostis tenuis Sibth.）、匍匐剪股颖（Agrostis stolonifera）和狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]。将其种子在西南林业大学园林学院实验室温室培养箱中于 25 ℃ 光照培养发芽。
　　1.2 DNA提取与检测
　　每个草坪草品种剪下由多颗种子萌发的幼嫩叶片进行液氮研磨，使用TIANGEN试剂盒提取总DNA。对提取的DNA原液进行1.0%琼脂糖凝胶、GoldView核酸染料电泳，检测其质量。保存在 -20 ℃ 冰箱中。
　　1.3 ISSR-PCR反应体系及扩增条件
　　本试验所用PCR反应体系为25 μL：ddH2O 18 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板100 ng，引物10 μmol/L，Trans Taq DNA聚合酶 0.5 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，40个循环;72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。
　　ISSR引物筛选。PCR反应结束后，将扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中检测。电泳条件为上样量 3 μL，1×TAE缓冲液，90 V电压下45 min。电泳结束后在凝胶成像系统上观测、拍照。用10个草种样本从28条引物（表1）中筛选出条带清晰、多态性高以及重复性好的引物。 　　1.4 指纹图谱的构建
　　用筛选出的引物分别对10种草坪草进行PCR扩增，调整退火温度。保存电泳结束后的图片，选择清晰、稳定以及重复性好的条带进行谱带记录。有带记为1，无带记为0，形成0、1矩阵。
　　2 结果与分析
　　2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果
　　由图1可知，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA，DNA样品均只有1条清晰完整的带，质量较好，能满足ISSR分析的需要。
　　2.2 ISSR引物的初筛选
　　由图2可知，以沟叶结缕草的基因组DNA为模板，从28条引物中预筛选出15条能扩增出产物的引物，分别是UBC818、UBC825、UBC826、UBC827、UBC834、UBC836、UBC840、UBC841、UBC842、UBC844、UBC848、UBC850、UBC855、UBC866、UBC857。
　　2.3 引物退火温度的确定
　　对15条引物进行退火温度的筛选，部分引物的
　　退火温度筛选结果如图3所示。由图3可知，引物UBC844在退火温度高于55 ℃时，扩增产物出现缺失现象;但退火温度低于55 ℃时，非特异性条带较多，随着温度的降低，条带弥散现象加重;在55 ℃时，条带之间界限分明，背景清晰，带型稳定。因此引物UBC844的最优退火温度选择55 ℃。
　　如图4所示，经筛选发现引物UBC834和UBC842的退火温度在58 ℃时，其PCR跑胶图片最为清晰，并且能够较好地区分10种草坪草品种。
　　2.4 草坪草DNA指纹图谱的构建
　　由上述ISSR-PCR扩增图谱发现，引物UBC834、UBC842和UBC844均可以将供试的10种草坪草品种全部区分开来。对3个引物的扩增图谱选择较为明亮的条带分别进行0、1读带，构建3个草坪草的数字指纹图谱（表2）。
　　3 讨论与结论
　　草坪草在城市绿化、足球场、高尔夫球场等一些功能性运动场上的应用越来越广泛，草坪业不断发展壮大，关于草坪草的研究也在不断地深入。李春杰等对混播草坪的研究发现，草坪中的黑麦草在建植后比列逐渐下降，高羊茅所占比例变化不大，早熟禾比例不断上升，但在建植后的1.5年时间内，黑麦草始终占据优势[18]。刘伟等通过不同的施氮量和修剪高度，探讨了比较适合高羊茅与日本结缕草混播的管理措施[19]。贺佳圆等研究了不同混播比例的高羊茅与草地早熟禾对草坪质量的影响，发现草地早熟禾与高羊茅混播比例为2 ∶8时，草坪质量最佳[20]。混播草坪已成为当今草坪建设的主要方式之一，昆明地区草坪基本以混播的形式存在，难以区分，不利于草坪针对性的施肥、病虫害等管理。
　　本试验以昆明地区常见草坪草为材料，从28条ISSR引物中筛选出3条多态性、稳定性以及重复性均良好的引物，分别为引物UBC834、引物UBC842、引物UBC844。利用这3条引物对10种草坪草的基因组DNA进行扩增，结果表明，3条引物均可以完全区分10种草坪草，利用这3条引物构建了昆明地区10种草坪草的3个数字指纹图谱。利用上述指纹图谱作为标准谱带，为昆明的草坪草品种鉴定提供了依据。在后续一些难以区分的混播草坪维护中，通过提取其DNA，使用引物UBC834、UBC842或UBC844，对其进行PCR扩增，然后将跑胶图片与本研究的标准谱带进行对比，即可鉴别出混播草坪的品种类型，然后有针对性地进行管理。本研究也为后续昆明地区草坪草遗传多样性分析、种质资源鉴定等提供了一定的技术基础。
　　参考文献：
　　[1]陈 蕴，吴开贤，罗富成. 我国草坪草引种研究现状与进展[J]. 草业科学，2008，25（10）：128-133.
　　[2]彭 燕，张新全，周寿荣. 我国主要草坪草种质资源研究进展[J]. 园艺学报，2005，32（2）：359-364.
　　[3]黄鹤平，郑 旴，黄青峰，等. 昆明地区10个草坪草品种的引种与评价[J]. 西南农业学报，2016，29（4）：934-939.
　　[4]郭志慧，杨红宇，张成林，等. 利用形态性状以及SSR标记鉴定4个川西北老芒麦品种（系）[J]. 草业科学，2016，33（9）：1718-1727.
　　[5]吴 婷，魏 珊，米丽华，等. 不同产地连翘的DNA指纹图谱构建与聚类分析[J]. 中草药，2016，47（5）：816-820.
　　[6]孙 宁，付小琼，王秀玲，等. 棉花区试品种的AFLP指纹图谱分析[J]. 中国农学通报，2012，28（15）：36-41.
　　[7]张俊超，谢文刚，赵旭红，等. 利用EST-SSR标记构建中国老芒麦品种DNA指纹图谱及种质遗传多样性[J]. 草业科学，2017，34（10）：2052-2062.
　　[8]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.
　　[9]贾俊香，崔连伟，李 娜，等. 大葱ISSR反应体系的建立及优化[J]. 北方园艺，2017（12）：92-96.
　　[10]王建波. ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]. 遗传，2002，24（5）：613-616.
　　[11]林万明. PCR技术操作和应用指南[M]. 北京：人民軍医出版社，1993：73-74.
　　[12]宣继萍，章 镇，房经贵，等. 苹果品种ISSR指纹图谱构建[J]. 果树学报，2002，19（6）：421-423.
　　[13]Zhao W G，Miao X X，Zang B，et al. Construction of fingerprinting and genetic diversity of mulberry cultivars in China by ISSR markers[J]. Acta Genetica Sinica，2006，33（9）：851-860.
　　[14]葛亚英，张 飞，沈晓岚，等. 丽穗凤梨ISSR遗传多样性分析与指纹图谱构建[J]. 中国农业科学，2012，45（4）：726-733.
　　[15]樊 杰，张 奇，吴 田，等. 云产品牌卷烟主体烟叶原料的复烤烟指纹图谱的构建[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2015，41（6）：627-630.
　　[16]刘 君，赵 琴，杨志民. ISSR分子标记对9种狗牙根的鉴定分析[J]. 草业学报，2012，21（6）：159-165.
　　[17]胡雪华，何亚丽，安 渊，等. 上海结缕草JD-1和结缕草属几个主要坪用草种的ISSR指纹分析[J]. 上海交通大学学报（农业科学版），2005，23（2）：163-167.
　　[18]李春杰，南志标. 混播对草坪建植与病害的影响[J]. 草业科学，2002，19（8）：63-66.
　　[19]刘 伟，张新全，李 芳，等. 西南区野生狗牙根遗传多样性的ISSR标记与地理来源分析[J]. 草业学报，2007，16（3）：55-61.
　　[20]贺佳圆，周建军，辛志图，等. 草地早熟禾与高羊茅不同混播比例对草坪质量的影响[J]. 草原与草坪，2016，36（2）：92-96.曹 访，刘 莉，采克俊，等. 五月龄翘嘴红鲌性腺组织小RNA转录谱的分析比较[J]. 江苏农业科学，2020，48（2）：77-82.
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