对头孢菌素C发酵工艺的优化研究
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作者: 张德重
[摘 要]目的：对头孢菌素C（CPC）发酵工艺的优化进行研究，通过对接种方法、发酵培养基的调整和碳源的替代，经实验可知，移种加倒种罐发酵水平比正常移种罐发酵水平高，并且通过将发酵培养基进行调整，实现减少发酵罐培养基豆油用量，发酵过程中流加葡萄糖方式，不仅提高了发酵水平，而且也减少了基础料的成本，同时降低了单批能耗，从而也降低了生产成本。
[关键词]头孢菌素C；发酵；培养基；工艺优化
中图分类号：S259 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）16-0343-01
头孢菌素C（CPC）经化学裂解法或酰化酶法去掉侧链而得到7-氨基头孢烷酸（7-ACA），7-ACA是合成的头孢类抗生素药物重要的医药中间体。头孢菌素C发酵培养基原材料成本占比7-ACA原材料成本70%以上，目前很多的生产厂家开始着力提升头孢菌素C的发酵水平，以降低7-ACA成本，进而降低头孢类抗生素药品成本提升市场竞争力。目前我国主要生产头孢菌素C的厂家主要包括：哈药集团、石药集团、华北制药集团、山东鲁抗、山西威奇达、健康元等几家企业。
CPC是由顶头孢霉菌初级代谢后在特定的环境条件下进行次次代谢产物。要想高效的提升CPC的发酵水平，就要从根本上入手，而CPC出现的根本就在于顶头孢霉菌的初级代谢。由于培养基中各种营养物质的浓度配比对菌体的生长和代谢有着明显的影响，所以要合理配制培养基中的营养物质浓度，以保障菌体的正常生长。充分认识到碳、氮等基本营养元素在顶头孢霉菌的代谢过程中的作用，而且要注意的是，在顶头孢霉菌代谢的过程中要控制接种量，对各方面影响因素进行充分的考虑，只有这样才能够最大限度的提高头孢菌素C的发酵水平。本文的实验就是针对接种方式、减少发酵培养基豆油用量，发酵过程中部分糖代油的的方式进行优化，从而提高头孢菌素C的发酵水平。
1.材料和方法
1.1 菌种
顶头孢霉菌（哈药集团制药总厂生产用菌种）。
1.2 培养基
1.2.1种子培养基：葡萄糖，蔗糖，玉米浆，烤花生粉末，豆油，硫酸铵，CaCO3，消沫剂，pH：6.4-6.6。
1.2.2发酵培养基：葡萄糖，玉米淀粉，豆油，玉米浆，花生饼粉，谷朊粉，DL-蛋氨酸（进口），CaCO3，硫酸钙、硫酸铵等无机盐，消沫剂，pH：6.1-6.3。
1.3 设备
1.3.1实验室设备：500ml锥形瓶，3000ml锥形瓶，30L发酵罐。
1.3.2发酵罐：一级种子罐500L，二级种子罐20m？，发酵罐60m？。
1.4 发酵周期
发酵周期为125±3h。
2.实验方法
2.1通过对接种方法优化，提高发酵水平。
2.2减少发酵培养基豆油用量，发酵过程中流加葡萄糖的的方式进行优化，对头孢菌素C的发酵生产工艺进行了改进。
2.3测定菌丝量方法：将均匀的发酵液倒入10mL刻度离心管中，置于离心机中，3500r/min下离心10min。
2.4头孢菌素C含量用HPLC测定，其色谱条件为：色谱柱为C18，4.6×25mm；流动相为乙腈：乙酸钠缓冲液（1：50），进样量20μl，流速：2.0ml/min，检测波长：254nm。
3.分析结果与讨论
3.1 接种方式的调整
头孢菌素C发酵种子的生长周期较长，但是发酵的周期却很短，这种特殊性决定了其要选用适合的发酵方式才能够保障发酵的水平。一般而言我国目前所采用的头孢菌素C发酵方式为三级发酵，但是在实际的移种过程中，由于发酵罐接种后有一个比较长时间的停滞期，在这一时期，很多因素会对发酵种子产生影响，从而使得头孢菌素C的发酵水平下降。而想要有效的保障头孢菌素C发酵水平，就要极大的缩短停滞期的时间，将生长状况良好的14m？二级种子移种到发酵罐中，这就是通常所说的移种罐。而通常的移种加倒种是指将10m？二级种子移入发酵罐后，再倒入4m？左发酵至45h左右右的发酵液，这样能够有效的减少停滞期，从而保障接种量。在移入的过程中，头孢菌素C合成所需要的酶也被共同带入，这样能够极大的促进菌丝量的增长，从而在整体上提高发酵水平。
为保障实验误差在最小值，本文进行了实验室规模的发酵实验确定了倒种罐的最佳周期为40～50小时为宜。随后进行了20批大生产验证，在这20批实验中，有10批属于正常接种罐，而另外10批属于是移种加倒种罐，从实验的结果可知，移种加倒种罐要比正常的移种罐的发酵整体水平要高。前者比后者的效价要高7.3%，而且在批总亿上也要高出8.0%左右，具体数据见下表。
移种加倒种的罐比正常移种罐有明显的优势，从开始效价就比正常移种罐批次高。
3.2 发酵培养基的调整及工艺优化
头孢菌素C发酵培养基营养十分丰富，尤其是豆油的加量非常大，但是头孢菌素C发酵是高耗氧的发酵，豆油过多使发酵过程中泡沫减少，溶氧偏低，如果发酵过程中溶氧一直偏低，不仅会造成发酵水平低，还会使发酵过程中DOCPC的含量增加，从而给后续的提取增加困难，并且会使提取收率降低。为了弥补溶氧，需要提高搅拌功率或增加通气量，从而增加了动力消耗。由于基础料中油过多，在很长的发酵周期内发酵液中都会存在大量的油，中间带放时这些油就会随发酵液带出，不仅造成营养浪费，而且发酵液中大量的残油会使酸化板框滤布频频更新增加成本。根据这种情况，通过降低基础料中的油，通过适当加大50小时后流加葡萄糖和豆油量，克服了发酵过程中30～50小时溶氧偏低，菌丝分化成孢子不完全的劣势，最终可以使125小时放罐CPC纯度达到81.32%左右，叫基础料较少豆油时提升了2.1%，且发酵罐在第一次带放时残油量已经很低，每批节省豆油1.2～1.5m？，大大降低了基础料的成本。且通过降低基础料中硫酸铵用量，在15～20小时发酵液中氨氮迅速消耗时，一次性补如350公斤硫酸铵（1.2m？，浓度30%左右），也可以改善前期溶氧，同时改变发酵液的无机盐浓度，进而可能会改变细胞渗透压，刺激微生物迅速生长，可以在45h时左右菌浓达到46（V/V），提前6小时左右，可以相应缩短发酵周期。
在头孢菌素C发酵过程中要不断地补入葡萄糖和豆油。由于豆油的价格比糖要高数倍，豆油在头孢菌素C的成本中占的比例很大，所以考虑加大葡萄糖的加量，降低豆油的加量。但由于大量的葡萄糖对头孢菌素C发酵有阻遏作用，如果葡萄糖过量就会造成发酵异常，所以葡萄糖又不能完全代替豆油。另外，由于在糖代油工艺调整过程中，糖增加的量大约是豆油加量的近3倍，所以在一定程度上对发酵液进行了稀释，使菌丝浓度降低了2%左右，过滤收率提高了0.7个百分点，同时由于流加葡萄糖量加大，使放罐时孢子形态较完整，CPC纯度也得到进一步保障。
3.结论
通过调种接种方式，移种加倒种罐比正常移种罐效价高7.3%，批总亿高8.0%左右；通过较少基料中的豆油及硫酸铵，通过后期一次性补加或增大流加量，每批节省豆油1.2～1.5m3，大大降低了基础料的成本；通过加大流加葡萄糖用量，相应减少豆油量，稀释了发酵液，使过滤收率提高0.7个百分点，同时由于流加葡萄糖量加大，使放罐时孢子形态较完整，CPC纯度也得到进一步保障。
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