青海地区藏族、汉族HIF—2a基因单核苷酸多态性与胃癌易感性的相关性研究

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　　[摘要] 目的 探討青海地区藏、汉族HIF-2α基因单核苷酸多态性与胃癌易感的相关性。 方法 收集青海省藏医院、青海大学附属肿瘤医院、青海省肿瘤医院就诊胃癌患者（长期居住于青海地区）藏族51例、汉族60例。使用外周血提取DNA。采用聚合酶链式反应（PCR）扩增，并使用测序法检测HIF-2α基因的3个位点，分别为rs6715787、13419896、7598371，同时行相关性分析。 结果 rs6715787、rs7598371的单核苷酸多态性（SNP）基因型分别为C/G、C/C、G/G，rs13419896的SNP基因型为A/G、G/G、A/A。两组基因型分布检验后符合Hardy-Weinberg平衡规律（P < 0.05）。藏、汉族胃癌组rs13419896的A/G、G/G、A/A基因型频率分别为27.45%、29.41%，43.13%、45.00%，43.33%、11.67%，基因型频率分布两组差异有高度统计学意义（χ2 = 14.195，P < 0.01），其等位基因差异有高度统计学意义（χ2 = 11.495，P < 0.01）。藏族胃癌组等位基因A频率分布高于汉族胃癌组。藏、汉族胃癌组rs7598371的C/G、C/C、G/G基因型频率分别为29.42%、37.25%、33.33%，41.67%、5.00%、53.33%，两组的基因型频率分布差异有统计学意义（χ2 = 18.118，P < 0.01），其等位基因差异有高度统计学意义（χ2 = 16.002，P < 0.01），藏族胃癌组等位基因C频率分布高于汉族胃癌组。藏、汉族胃癌组rs6715787的C/G、C/C、G/G基因型频率分别为35.29%、41.18%，23.52%、51.67%，8.33%、40.00%。两组基因型频率分布差异有高度统计学意义（χ2 = 16.675，P < 0.01），其等位基因差异有高度统计学意义（χ2 = 13.518，P < 0.01），藏族胃癌组等位基因C频率分布明显高于汉族胃癌组。基因位点藏汉族胃癌患者表达不同，其中青海地区藏族人群胃癌患者携带C/C型的HIF-2α基因的rs6715787高表达，藏族人群胃癌患者携带C/C型的HIF-2α基因rs7598371高表达，汉族人群胃癌患者携带C/G型的HIF-2α基因rs6715787高表达，汉族人群胃癌患者携带G/G型的HIF-2α基因rs7598371高表达。 结论 HIF-2α基因rs7598371、rs6715787、rs13419896与青海地区藏汉族胃癌可能无相关性，但青海地区藏族胃癌、汉族胃癌HIF-2α基因单核苷酸多态性存在差异，基因位点藏汉族对照组、藏汉族胃癌患者表达不同，提示青海地区藏族胃癌、汉族胃癌患者的基因型不同，遗传基础可能不同。
　　[关键词] 汉族；藏族；胃癌；HIF-2α基因；单核苷酸多态性
　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（c）-0009-05
　　The relationship between single nucleotide polymorphism of HIF-2α gene and susceptibility to gastric cancer of Qinghai area Tibetan， Han nationality
　　MA Jinhua1 MA Jinlan2 WANG Lijuan1 LI Jinzhang1 SHEN Cunfang1 MA Jinxiang3
　　1.Department of Medical Oncology， Qinghai University Affiliated Hospital， Qinghai Province， Xi′ning 810001， China；
　　2.Department of Nephrology， Qinghai University Affiliated Hospital， Qinghai Province， Xi′ning 810001， China； 3.Medical College， Qinghai University， Qinghai Province， Xi′ning 810001， China
　　[Abstract] Objective To explore relationship between single nucleotide polymorphism of HIF-2Αα gene and susceptibility to gastric cancer of Qinghai area Tibetan， Han nationality. Methods A total of 51 Tibetan and 60 Han nationality patients （long lived in Qinghai area） with gastric cancer were collected. DNA was extracted from peripheral blood. Polymerase chain reaction （PCR） was used to detect 3 sites of HIF-2α gene， namely rs6715787， 13419896 and 7598371， and correlation analysis was performed. Results The SNP genotypes of rs6715787 and rs7598371 were C/G， C/C and G/G， respectively， and the SNP genotypes of rs13419896 were A/G， G/G and A/A. The genotype frequencies of A/G， G/G and A/A in rs13419896 of Tibetan and Han nationality groups were 27.45%， 29.41%， 43.13% and 45.00%， 43.33%， 11.67%， respectively. The difference in genotype frequency distribution between the two groups was highly statistically significant （χ2 = 13.518， P < 0.01）， and the difference in allele was highly statistically significant （χ2 = 14.195， P < 0.01）. The allele difference was statistically significant （χ2 = 11.495， P < 0.01）. The frequency distribution of allele A in Tibetan gastric cancer group was higher than that in Han nationality gastric cancer group. The C/G， C/C， G/G genotype frequencies of rs7598371 in the Tibetan and Han nationality groups were 29.42%， 37.25%， 33.33% and 41.67%， 5.00%， 53.33%， respectively. The difference of genotype frequency distribution between the two groups was highly statistically significant （χ2 = 18.118， P < 0.01）， and the allele differences were highly statistically significant （χ2 = 16.002， P < 0.01）. The frequency distribution of allele C in Tibetan nationality gastric cancer group was higher than that in Han nationality gastric cancer group. The genotype distribution of the two groups was consistent with Hardy-Weinberg equilibrium law （P < 0.05）. The C/G， C/C， G/G genotype frequencies of rs6715787 in the Tibetan and Han nationality group were 35.29%， 41.18%， 23.52% and 51.67%， 8.33%， 40.00%， respectively. The frequency distribution of allele C in Tibetan nationality gastric cancer group was highly significantly Higher nationality than that in han gastric cancer group （χ2 = 16.675， P < 0.01）. The expression of the gene loci was different in the Tibetan and Han nationality patients with gastric cancer， among which the high expression of HIF-2α gene of C/C type in the gastric cancer patients of Tibetan population in Qinghai province was found in rs6715787. The HIF-2α gene rs7598371 of C/C type was highly expressed in Tibetan gastric cancer patients. HIF-2α gene rs6715787 of C/G type is highly expressed in gastric cancer patients of Han nationality. The HIF-2α gene rs7598371 of G/G type was highly expressed in gastric cancer patients of Han nationality. Conclusion HIF-2α gene rs7598371， rs6715787， rs13419896 gastric cancer may be no correlation between the Han nationaltiy Chinese region of Qinghai Tibetan but region of Qinghai Tibetan， Han nationaltiy gastric cancer HIF-2α gene single nucleotide polymorphisms vary， gene loci to hide the control group， Tibetan and Han nationaltiy patients with gastric cancer express different， tip region of Qinghai Tibetan， Han nationaltiy gastric cancer patients with different genotypes， genetic basis may be different. 　　[Key words] Han nationality； Tibetan nationality； Gastric cancer； HIF-2α gene； Single nucleotide polymorphism
　　胃癌的发生是由基因和环境因素共同作用的结果。流行病学资料显示，青海地区是我国胃癌高发地区之一，胃癌死亡率居全国前列，达40.62/10万[1]，胃癌的发生不仅与高原环境和特殊饮食习惯有关[2-5]，可能与不同民族的遗传背景有关。多个民族在青海世居，其中藏族137.5062万人，占24.44%。为了解青海地区藏汉族胃癌与HIF-2α基因单核苷酸多态性之间相关性，开展以下研究。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　通过青海大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准，收集2015年5月～2017年12月于青海省藏医院、青海大学附属肿瘤医院、青海省肿瘤医院就诊的藏、汉族新发胃癌患者分别为51、60例。藏族胃癌组男30例，女21例；年龄20～78岁，平均（48.6±5.2）岁。汉族胃癌组男36例，女24例；年龄22～80岁，平均（47.1±5.7）岁。所有患者病理确诊为胃腺癌。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
　　1.2 主要仪器与试剂
　　聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（Verity 96well，美国ABI），凝胶成像仪（Gene Genius，英国Syngene），3730XL测序仪（美国ABI），DNA marker（加拿大BBI公司），基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司，生产批号：E604KA8640），PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 血液采集 受试者晨起空腹采集外周静脉血2 mL，采用EDTA抗凝处理。
　　1.3.2 基因组DNA提取 取上述血样品，采用DNA试剂盒提取，电泳检测其完整度，分光光度计测其含量、纯度，-20℃冰箱保存备用。
　　1.3.3 引物设计与合成 以美国国家生物信息中心的GenBank获取HIF-2a基因序列及相应位点的单核苷酸多态性（SNP）信息。使用PrimerExpress 2.0软件辅助设计引物。见表1。
　　1.3.4 PCR反应 基因组DNA为模板，设计将HIF-2α基因的rs13419896、rs7598371、rs6715787引物建立PCR反应体系25 μL：DNA模板1 μL，Taq buffer为2.5 μL，dNTP、上下游引物各0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 14.8 μL。PCR的条件为：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，进行35个循环；72℃后延伸10 min。5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶上100 V电压下电泳40 min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相、保存。扩增产物纯化后送测序、进行SNP技术分型，以测序结果确定基因频率、基因型并比较。巢式PCR优化体系的建立：采用巢式PCR扩增法即经2次PCR放大，可将单拷贝的目的DNA片段充分的扩增，以达检出的目的。
　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 結果
　　2.1 DNA电泳检测结果
　　藏汉族胃癌组结果见图1。
　　2.2 PCR产物检测结果
　　以上述DNA为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。
　　2.3 基因测序结果
　　HIF-2α基因rs6715787、rs13419896、rs7598371的SNP基因型分别是C/G、C/C、G/G型，A/G、G/G、A/A型，C/G、C/C、G/G型。
　　2.4 基因型、基因频率分布结果
　　2.4.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果 rs6715787、rs13419896、rs7598371的SNP基因型分别为C/G、C/C、G/G，A/G、G/G、A/A，C/G、C/C、G/G。对照组检验基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡规律（rs13419896 SNP：χ2 = 10.23，P < 0.05；rs7598371SNP：χ2 = 13.35，P < 0.05；rs6715787SNP：χ2 = 7.47，P < 0.05）。
　　2.4.2 rs13419896的SNP基因型及等位基因频率分布 两组基因型频率分布差异有高度统计学意义（χ2 = 14.195，P < 0.01），其等位基因差异也存在高度统计学意义（χ2 = 11.495，P < 0.01），藏族胃癌组等位基因A频率分布明显高于汉族胃癌组。见表1。
　　2.4.3 rs7598371的SNP基因型及等位基因频率分布 两组基因型频率分布差异有高度统计学意义（χ2 = 18.118，P < 0.01），在汉族胃癌组中频率最高基因型分别为C/C型和G/G型。rs7598371等位基因差异有高度统计学意义（χ2 = 16.002，P < 0.01），藏族胃癌组等位基因C频率分布明显高于汉族胃癌组。见表2。
　　2.4.4 rs6715787的SNP基因型及等位基因频率分布 两组基因型频率分布差异有高度统计学意义（χ2 = 16.675，P < 0.01），在汉族胃癌组中最高者分别为C/C型和G/G型，等位基因差异有高度统计学意义（χ2 = 13.518，P < 0.01），藏族胃癌组等位基因C频率分布明显高于汉族胃癌组。见表3。 　　3 讨论
　　世界上大多数国家、地区高发的肿瘤类型均有所差异，原因考虑为基因多态性人群导致不同人群对肿瘤易感性的差异及种族和地域分布上体现出的差异。胃癌的发生、发展是内、外环境及个体遗传多基因、多因素共同作用的结果，各地区各民族胃癌发生率均有不同[6]。
　　HIF基因是低氧诱导调节通路中的主要基因，HIF-2α是缺氧调节的关键转录因子之一，与高原适应相关，机体免于罹患高原疾病的一个重要遗传规则就是HIF基因的多态性，在生物体正常高原适应性生理调节及肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用[7-8]。HIF-2α可识别、结合调控基因中的缺氧诱导因子，调控下游基因的合成，在恶性肿瘤浸润性生长、新生血管生成及远处转移等过程中发挥调节作用[9-12]。刘晓丽等[13]研究表明了HIF-1α对于高原藏族胃癌的形成具有促进意义。在2010年李强等[14]研究中指出，HIF-2α在胃癌发生、发展中发挥一定的作用。在非小细胞肺癌中的研究[15]结果显示：HIF-2α的增量表达与血管生长因子（VEGF）表达以及预后也存在紧密联系，并容易在VHL突变型肿瘤中发生上调，曾有研究认为肿瘤干细胞的驱动因素之一可能是HIF-2α[16-17]。因此，HIF作为肿瘤治疗的新的有一定价值的靶点，其研究成为热点[18]，单核苷酸多态性（SNP）已成为常用的遗传标记[19]。本研究初步表明青海汉藏族基因型分布频率存在差异，HIF-2α和年龄、分化程度及淋巴结转移等无相关性（P > 0.05）；与VEGF表达关系密切（P < 0.05），提示HIF-2和胃癌的发生发展、浸润和转移有紧密联系，与文献[20]报道一致，提示HIF-2α基因位点在不同民族可能有差异，由于藏族人群有较严格的本民族内通婚习俗，相对基因比较独立，可能是与汉族基因有差异的原因。
　　在青海地区藏汉族HIF-2α基因rs13419896、rs7598371、rs6715787位点的多态性及胃癌易感性的研究中，其相关性对胃癌高危人群的筛查及诊断有一定的意义。本研究的技术为“巢式PCR-RFLP”基因分型技术，该技术同时对多个位点进行分析。结果表明HIF-1、2α因子的表达和高原藏汉族胃癌的发生发展具有一定的表达差异。但该实验存在以下问题：HIF-2a基因多态性与恶性肿瘤之间的关系可能存在不同种族、不同民族的差异性；本研究纳入病例60例左右，研究样本量较少，结论可能不可靠，需扩大样本量和分型人群进一步研究。
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　　（收稿日期：2018-09-18 本文编辑：金 虹）
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