水飞蓟宾对0J小鼠致肝损伤的改善机制研究

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　　【摘要】探讨水飞蓟宾通过iNOS/NF-KB信号通路对梗阻性黄疸小鼠肝细胞修复与再生的作用机制。构建小鼠梗阻性黄疸模型20只，随机分成模型组（M）、药物组（S）、空白组（S0）。发现构模小鼠皮肤黄染严重，肝索紊乱，血液中总TBIL及AST超标，出现空泡及核裂变，iNOS、NF-KB、TNF-a、Par-4mRNA表达上升。S组有较明显改善。提示水飞蓟宾能增强梗阻性黄疸致肝损伤后小鼠的免疫功能及肝细胞的修复能力，其机制可能是通过调控iNOS/NF-KB通路相关细胞因子表达和保持肝细胞的完整性。
　　【关键词】水飞蓟宾;阻塞性黄疸致肝损伤;iNOS/NF-KB;TNF-α;小鼠
　　1前言
　　由于各种因素导致肝内外胆管阻塞引起胆汁流通障碍是梗阻性黄疸发生的主要原因。水飞蓟宾是从罕见的菊利植物水飞蓟果实中提取分离的黄酮类化合物，能保证肝细胞膜的完整性和修复性。在病理情况下iNOS表达显著升高产生NO，造成细胞代谢障碍及增强炎症反应。联合NF-KB能调控组织损伤中多种炎症介质的编码基因。本研究以阻塞性黄疸构建小鼠肝损伤模型，通过水飞蓟宾干预，观察肝组织iNOS、NF-KB、TSF-α、Par-4的表达，探讨其在阻塞性黄疸致肝损伤、修复相关机制，为相关疾病研究提供理论和实验依据。
　　2材料与方法
　　2.1实验对象及模型构建
　　健康昆明种雄性小鼠30只，构建小鼠梗阻性黄疸模型20只，随机分成模型组（M）、药物组（S），设空白组（SO）10例。水飞蓟宾灌胃：按人与小鼠体表面积折算等效剂量经口灌胃，每天（下午4时）灌胃一次，剂量0.4mL/次（浓度为30mg/kg），7d/w，共7周。构模：腹腔注射异戊巴比妥（500mg/kg）进行麻醉。腹部剑突下1cm进行局部消毒，并剪去毛发。眼科剪纵向开l.2cm手术切口，暴露肝脏，棉絮棒轻微拨开肝叶，暴露胆总管，玻璃分针进行分离，4-0不可吸收手术线将其成90。弯曲悬挂于腹壁，缝合切口。
　　2.2一般情况及血生化观察
　　对所有小鼠肝脏形态、排泄物、活动状态等进行综合性评价。血清中总胆红素（TBIL）和谷草转氨酶（AST）含量检测按照说明书操作步骤在半自动生化分析仪上进行。
　　2.3病理学切片
　　取厚3.0mm石蜡切片，脱蜡、脱水，HE染色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜（X200）下观察肝脏组织形态学。
　　2.4肝组织iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA检测
　　总mRNA提取采用动物组织RNAprepPure Tissue Kit试剂盒;并按说明书进行操作。仪器：ABI 7900HT，试剂：SYBRPremix Ex TaqTM（Takara）试剂盒。按说明书进行操作，引物合成设计由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
　　2.5统计学处理
　　采用中文SPSS20.0软件进行统计学分析，并采用SigmaPlotl0.0软件作图，数据统计以平均数±标准差（x±s）来表示，组间对比分析采用单因素方差分析方法，若P<0.05表示为具有显著统计学意义，若P<0.01表示为具有非常显著统计学意义。
　　3结果与分析
　　3.1一般行为学及生化检测
　　SO组小鼠肝脏颜色红润，质地柔软。M组呈暗褐色，显现颗粒状突起且兴奋性降低，粪便呈现苍白色。S组症状有明显好转。血生化结果表明，与M（84.34±9.07）相比，S组的血清ALT（50.18±7.61）含量显著下降（P<0.01）。TBIL含量M组（27.25±4.92）明显高于s组（7.64±4.18），具有非常显著性差异（P<0.01）。
　　3.2HE染色
　　肝组织HE染色发现：M组肝索结构紊乱，存在大量核固缩、空泡，甚至消失。肝小叶破坏显著，细胞质基质斑状聚集。相比M组，S组肝小叶损伤缓解，有少量空泡，肝索結构清晰可见。SO组无明显病变症状。
　　3.3qRT-PCR结果
　　qRT-PCR检测结果，肝组织中iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表达在M组中表达最高，S组相对降低（P<0.01）;相比S组，SO组各因子mRNA表达明显下降（P<0.01）。
　　4讨论
　　梗阻性黄疸疾病的主要原因是肝内外胆管完全或不完全阻塞，导致胆汁淤积所致。其表现为肤色、巩膜出现黄染，血清总胆红素明显增加。抑制炎症反应的发生，降低炎性因子的释放，促进机体免疫功能的恢复，防止诱发其它并发症是治疗梗阻性黄疸病致肝损伤的首要目标，在科研实验中能较好模拟人类梗阻性黄疸发病机制的动物模型成为研究的关键。本实验采用昆明小鼠作为研究对象，悬挂胆总管造成胆管阻塞构建梗阻性黄疸模型，构模后小鼠腹部等多处出现黄染，血清总胆红素等多项生化指标超标。故判断模型构建成功，并应用于本研究。
　　目前，调控细胞因子与免疫系统的关系受到研究者们的关注。梗黄的发生可促进相关炎性细胞因子的超负荷释放，增强炎症反应的发生，复杂的免疫系统，调控或抑制单一炎症介质无法有效影响整个免疫介质网络。故寻找炎症反应上游重要调控因子，并清楚各因子间的作用机制，才能得到有效的干预效果。梗黄致肝损伤后促使活化的白细胞聚集于肝组织微血管，激活大量炎性介质，同时中性粒细胞募集，增强炎症反应的发生NF-KB能调控组织损伤中多种炎症介质的编码基因，加重炎症反应。联合iNOS可产生剧烈细胞毒性效果，本实验中，肝组织iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表达显著增多，提示小鼠肝组织炎症反应增强，S组iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4蛋白及mRNA相比M组降低显著，提示7周水飞蓟宾灌胃可减轻或缓解肝损伤。
　　5结论
　　水飞蓟宾能缓解或减轻梗阻性黄疸小鼠肝损伤的进一步扩张，其机制可能通过调节iNOS/NF-KB信号通路，加强梗黄小鼠免疫及抗炎能力，促进肝细胞修复与再生。
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