肝损伤动物模型的研究进展

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　　[摘要]近年来肝病的发病率呈逐年上升趋势，严重影响患者的生存质量。目前寻求治疗肝损伤药物的基础是如何建立疾病的动物模型，本文通过分析近几年有关肝损伤方面的文献，总结急性肝损伤、慢性肝损伤、药物性肝损伤、酒精性肝损伤的造模方法并探讨肝损伤的机制，现作以下综述。
　　[关键词]肝损伤；急性；慢性；进展
　　[中图分类号] R965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0038-04
　　Progress in animal models of liver injury
　　XU Bo1 TIAN Jing1 MA Ning1 WU Wei-nan2
　　1. Experimental center， Basic Medical College of Jilin Medical College， Jilin Province， Jilin 132013， China； 2. Department of General Surgery， Jilin Central Hospital of Jilin Province， Jilin 132011， China
　　[Abstract] In recent years， the incidence of liver disease is increasing year by year， which seriously affects the quality of life of patients. How to establish animal models of diseases is the basis of searching for drugs to treat liver injury， by analyzing the literatures about liver injury in recent years， to summarize the methods of establishing models of acute liver injury， chronic liver injury， drug-induced liver injury and alcoholic liver injury， and to explore the mechanism of liver injury.
　　[Key words] Liver injury； Acute； Chronic； Progress
　　近年來，肝脏疾病已经成为威胁人类健康的常见疾病之一。导致肝损伤的因素有很多，主要有以下几点：抗结核药物引起药物性肝损伤、酗酒引起的酒精性肝损伤、化学试剂引起的化学性肝损伤。由于个体免疫功能有所差别，会出现不同程度的肝损伤。免疫功能弱的人群多数会发展成为慢性肝损伤，肝细胞不断遭到破坏，最终会导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。免疫功能强的人群会发展成为急性肝损伤。建立肝损伤动物模型是研究肝损伤机制和寻找治疗肝损伤药物的一个重要方法。本文通过总结近几年肝损伤动物模型的制备方法，为进一步研究肝损伤提供新视角。
　　1四氯化碳诱导急性肝损伤模型
　　1.1四氯化碳诱导急性肝损伤模型的相关机制
　　四氯化碳导致小鼠急性肝损伤主要是破坏了小鼠的肝细胞，肝细胞内的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）透过肝细胞膜进入血液，导致血液中转氨酶活性升高。正常情况下，ALT和AST分别存在于肝细胞质和肝细胞线粒体内，只有极少量入血。杜斌等[1]研究显示，当肝组织受到急性损伤或细胞膜通透性增加时，ALT和AST大量进入血液。有研究显示，四氯化碳可以通过细胞色素P450系统的生物转化[2]，产生高能反应，从而诱发急性肝损伤。
　　1.2造模方法及结果
　　盛云华等[3]给小鼠腹腔注射16 mg/kg四氯化碳植物油造模，造模的体积为10 ml/kg。阴性小鼠给予植物油灌胃，禁食不禁水。周迎春[4]用1%四氯化碳花生油溶液给小鼠灌胃，灌胃的剂量为0.1 ml/10 g。此外，谷宁宁[5]对大鼠腹腔注射四氯化碳，导致大鼠急性肝损伤。造模前，小鼠的饮食、活动及精神状态良好。造模后，小鼠状态发生改变，但体重改变不大。通过眼球取血，检测血清中ALT、AST的酶活性，判断造模是否成功。结果显示，腹腔注射不同浓度的四氯化碳可使血清中ALT和AST的酶活性升高，ALT升高明显，1%肝细胞损伤时ALT水平即升高一倍[6]，只有肝细胞损伤达到一定程度才升高血清中的AST。腹腔注射不同浓度的四氯化碳可以建立急性肝损伤的动物模型。
　　2对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤模型
　　2.1对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤模型的机制
　　对乙酰氨基酚（APAP）的毒性与肝内代谢有关。在肝内，少量APAP可以被CYP2E1酶降解为高毒性的活性代谢物N-乙酰-对-苯醌亚胺（NAPQI）。少剂量的NAPQI可以被线粒体中的内谷胱甘肽（GSH）解除毒性。张冬梅等[7]得出对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤的机制为当APAP过量时，其代谢过程产生大量的NAPQI，超过了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQI与细胞内线粒体结合，破坏线粒体膜并最终导致肝细胞坏死。有研究显示[8]，当APAP代谢产生的NAPQI超过细胞的解毒能力时，细胞内堆积大量的自由基，发生氧化应激反应。
　　2.2造模方法及结果
　　潘海华等[9]在末次给药12 h后对小鼠腹腔注射500 mg/kg APAP溶液进行造模。郑惠星[10]也通过腹腔注射APAP溶液的方法造模，造模剂量为300 mg/kg。此外，刘华等[11]在末次给药30 min后对大鼠皮下注射450 mg/kg APAP溶液制造大鼠急性肝损伤模型。造模前，肝细胞完整，肝组织完好，肝小叶正常。造模后，肝小叶周围的肝细胞出现坏死，肝细胞的正常形态被破坏。光学显微镜中结果显示，肝小叶内细胞有浸润现象，肝小叶内存在炎症。在APAP处理4 h的时候肝细胞出现严重坏死。生化指标检测显示，血清中ALT和AST的浓度均上升，GSH的浓度降低。 　　3 ConA诱导慢性肝损伤模型
　　3.1 ConA诱导慢性肝损伤模型的机制
　　ConA诱导的肝损伤与免疫应答有关。赵晨翔等[12]得出ConA诱导小鼠肝损伤的机制为刀豆蛋白与肝窦内巨噬细胞结合，使T淋巴细胞进入肝窦，释放炎性介质，损伤肝细胞。肝细胞膜被破坏，肝细胞内ALT、AST大量进入血液，ALT、AST浓度随着ConA剂量的增加而升高。
　　3.2造模方法及结果
　　文献研究结果显示[13]，采用ConA以10 mg/kg（1 g/LPBS溶液）对小鼠进行尾静脉注射，每周1次，连续注射4周，制造小鼠慢性肝损伤模型。赵燕平等[14]采用5 mg/kg ConA对小鼠进行尾静脉注射，隔天1次，共两周，诱发小鼠肝损伤模型。摘取小鼠眼球取血，通过测定血清中ALT、AST的含量，发现两种转氨酶的浓度均上升，且转氨酶的活性均升高。造模4 h后可观察到模型组肝细胞炎性活动度增加，肝脏坏死处有大量的炎性细胞、淋巴细胞浸润。肝小叶结构被破坏，肝索消失，肝小叶内细胞形态发生改变，模型动物的肝脏出现纤维化症状，ConA造模成功。
　　4抗结核药物（异烟肼联合利福平）诱导肝损伤模型
　　4.1抗结核药物（异烟肼联合利福平）诱导肝损伤模型的机制
　　郭瑶雪等[15]研究显示，异烟肼可以降低甚至抑制线粒体呼吸链中酶的活性。打破线粒体的正常功能，使线粒体损伤，干扰细胞能量代谢，导致细胞凋亡。文献研究显示[16]，异烟肼和利福平导致肝损伤的机制是通过激活死亡因子受体（Fas）介导的死亡通路，诱导肝细胞大量凋亡，肝细胞內的ALT和AST大量入血，血液中转氨酶活性上升。
　　4.2造模方法及结果
　　陈娅等[17]用异烟肼+利福平各50 mg/kg给BW大鼠灌胃，建立大鼠的肝损伤模型。朱凌妍等[18]通过给予成年大鼠55 mg/kg的异烟肼药物1次/d，连续给药28 d，建立大鼠肝损伤模型。低剂量的异烟肼灌胃导致大鼠的肝细胞出现脂肪变性和水肿，高剂量异烟肼导致大鼠死亡。HE染色后显微镜下观察肝组织显示，肝细胞的胞浆比较疏松，肝组织大部分呈碎片状坏死，肝索消失，肝血窦变窄或几乎消失，肝细胞损伤严重。生化指标显示，大鼠血清中ALT和AST浓度明显升高，血清中各种酶的活性升高，肝损伤造模成功。
　　5酒精诱导肝损伤模型
　　5.1酒精性肝损伤模型的机制
　　酒精在肝脏内的代谢可产生大量自由基。过量的自由基可氧化生物膜脂质，破坏线粒体膜和肝细胞膜，导致ALT和AST大量入血。何志刚等[19]研究显示，摄入过量酒精产生的肠源性内毒素可活化核因子κB（NF-κB）炎症信号通路。检测酒精性肝损伤的指标有丙二醛（MDA）、GSH、血清超氧化物歧化酶（SOD）、三酰甘油（TG）[20-21]。MDA可作为反映机体组织或细胞受自由基攻击和损伤的指标；GSH和SOD活力的高低可以反映机体清除自由基和抗氧化能力的高低；TG可作为脂肪堆积的指标；乙醇在乙醇脱氢酶的作用下转化为乙酸，抑制三羧酸循环，导致脂肪堆积，肝组织TG指标上升。
　　5.2酒精导致的急性肝损伤模型造模方法及结果
　　彭国霞等[22]用5.0 g/kg酒精给小鼠灌胃，建立小鼠急性肝损伤模型。漆乐媛等[23]在末次给药后2 h，给小鼠灌胃15 ml/kg白酒，每12 h灌胃1次，一共两次，成功造模。造模后的小鼠出现精神萎靡、活动迟缓、嗜睡、走路不平稳、呼吸急促等醉酒状态。7 h后小鼠逐渐恢复清醒状态，取小鼠肝脏称重，模型小鼠的肝脏重于空白组小鼠。显微镜下观察小鼠肝组织显示，肝组织中央静脉及小叶间静脉周围出现肝细胞肿大[24]，肝索紊乱，肝血窦变窄或消失，肝细胞的胞浆比较疏松，呈水样变性及炎性细胞浸润。生化指标检测显示，ALT、AST、MDA、TG的浓度均升高，GSH和SOD浓度下降。
　　5.3酒精导致的慢性肝损伤模型造模方法及结果
　　陈志亮等[25]用0.7 ml/100 g 30%的乙醇每日定时给大鼠灌胃，建立大鼠慢性肝损伤模型。官堂明等[26]在每次给药6 h后，用体积分数为50%的乙醇溶液灌胃，灌胃的剂量12 ml/kg，成功建立小鼠慢性肝损伤模型。有文献研究显示[27]，可以用梯度乙醇浓度对小鼠灌胃来建立小鼠酒精性慢性肝损伤的模型。何志刚等[28]用0.1 ml/10 g 30%的乙醇对小鼠进行灌胃，每5天增加5%的浓度，直到45%，成功建立了小鼠慢性肝损伤的模型。大鼠毛发色泽差，食欲缺乏，肝脏较暗。显微镜下观察组大鼠的肝小叶内可见灶状坏死，坏死的部位多在中央静脉周围。肝细胞坏死多，坏死区内大量炎症细胞浸润，中性粒细胞浸润明显。王军伟等[29]研究显示，模型组大鼠血清中ALT和AST水平明显上升。
　　6总结
　　在四氯化碳急性肝损伤模型中，采取四氯化碳植物油进行灌胃或者腹腔注射的方法（在配置溶液时要注意四氯化碳不易溶于植物油，所以要充分混匀，且现配现用），灌胃的剂量为0.1 ml/10 g，腹腔注射的剂量为16 mg/kg。在对乙酰氨基酚急性肝损伤模型中，采取腹腔注射或皮下注射的方法，腹腔注射的剂量为500 mg/kg或300 mg/kg，皮下注射的剂量为450 mg/kg。在ConA慢性肝损伤模型中，采取尾静脉注射的方法造模，造模剂量为10 mg/kg或5 mg/kg。在抗结核药物模型中，用异烟肼+利福平各50 mg/kg·BW灌胃或55 mg/kg异烟肼持续给药，成功建立肝损伤模型。在酒精性肝损伤模型中，采取灌胃的方法造模，急性肝损伤的造模剂量为5.0 g/kg或15 ml/kg，慢性肝损伤的造模剂量为0.7 ml/100 g（30%乙醇）或12 ml/kg（50%乙醇）。在造模过程中，衡量造模结果的生化指标是血清中ALT和AST的浓度，在对乙酰氨基酚和酒精性肝损伤模型中，SOD和GSH的浓度也是衡量造模是否成功的标准。 　　综上所述，不同类型的肝损伤必须要采取不同的造模方法。不同肝损伤模型有助于研究治疗肝损伤的药物和治疗方法，为研究肝损伤提供开辟新视觉，为解决人类肝脏疾病提供实验基础。
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　　（收稿日期：2018-11-02 本文编辑：刘克明）
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