复方健肾颗粒的质量控制研究

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　　[摘要] 目的 建立復方健肾颗粒的质量标准，为其质量控制提供依据。 方法 根据2010版药典对于颗粒剂的质量要求，主要从性状、薄层鉴别、检查、含量测定等方面对复发健肾颗粒进行质量评价，其中以黄芪甲苷、腺苷对照品和熟地、黄精对照药材进行制剂的鉴别研究;建立HPLC法，测定制剂中黄芪甲苷和腺苷的含量。 结果 黄芪、熟地、黄精、蝉花的薄层斑点清晰，圆整，阴性制剂无干扰。粒度、水分、溶化性、装量差异符合要求。定量分析黄芪甲苷在2.70～9.45 μg范围内的回归方程为：log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，平均回收率100.45%，RSD为2.81%。复方健肾颗粒中黄芪甲苷含量限度为0.0356%，定量分析腺苷在浓度0.628～7.536 μg/mL范围内的回归方程为：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，平均回收率97.71%，RSD为1.95%。复方健肾颗粒中腺苷含量限度为0.005%。结论 方法稳定可行，重复性好，操作简单、方便，适用于复方健肾颗粒的质量控制。
　　[关键词] 复方健肾颗粒;质量评价;薄层色谱;黄芪甲苷;腺苷;含量测定
　　[中图分类号] R286          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）36-0037-07
　　Study on the quality control of compound Jianshen granules
　　CHEN Ping MI Wanwan YING Yuanyuan WANG Hangli ZHANG Mengdi HUANG Shengwu
　　Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   311400， China
　　[Abstract] Objective To establish the quality standard of compound Jianshen granules and provide the basis for its quality control. Methods Inaccordance with the quality requirements of granules in Pharmacopoeia 2010， the quality of compound Jianshen granules was evaluated in terms of properties， thin-layer identification， inspection and content determination， among which the identification study was performed using Astragaloside， Adenosine as control herbs and Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatumas control materialsrespectively.And High Performance Liquid Chromatography（HPLC） method was established for the determination of Astragaloside and Adenosine in preparations. Results The thin-layer chromatography（TLC） spots of Astragalus， Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatum and Cordycepssobolifera were clear， round and normal， and the negative preparation had no interference. The differences of granules size， water content， solubility and loading amount met the requirements. The regression equation of Astragaloside in the range of 2.70～9.45 μg was log（Y）=1.419log（X）+4.0412， R2=0.9993， the average recovery rate was 100.45%， relative standard deviation（RSD） was 2.81%. The content limit of Astragaloside in compound Jianshen granules was 0.0356%. The regression equation of Adenosine in the range of 0.628-7.536 μg/mL was Y=74.354x+14.256， R2=0.9993， the average recovery rate was 97.71%， RSD was 1.95%. The content limit of Adenosine in compound Jianshen granules was 0.005%. Conclusion This method is stable， feasible， reproducible， easy to operate， facility and suitable for the quality control of compound Jianshen granules. 　　[Key words] Compound Jianshen granules; Quality evaluation; Thin-layer chromatography; Astragaloside; Adenosine; Content determination
　　随着人们经济生活水平的提高，DM的患病率逐年增高，流行病学研究表明在非传染性疾病中DM发病率仅次于肿瘤及心血管病变，已经成为威胁人们生命健康的重要公共卫生问题之一[1]。预计到2030年全世界范围内2型糖尿病的患病率将达到500万[2-3]，其中将近1/4～1/3发展为DN[4-5]，在DN发病后，约20%将发展成终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）[6-7]。DN已逐渐取代DM急性并发症成为严重影响患者生活生存质量及威胁患者生命的主要因素，是导致ESRD的最重要病因[8]。
　　复方健肾方是名中医临床经验方，具有降低血糖、保护肾脏的功能。组方为：熟地18 g、黄芪12 g、黄精12 g、蝉花6 g。前期工作已建立复方健肾颗粒提取工艺方法学以及提取工艺研究，并根据现代制剂的要求制备成颗粒剂。后期在此临床经验方的基础上也进行了小活络缓释微丸等制剂的研究，为后期实验提供坚实的理论基础。根据相关参考文献[9-12]，黄芪和蝉花的鉴别以黄芪甲苷和腺苷标准品作为对照，熟地和黄精以其对照药材作为对照。黄芪中的皂苷类、多糖类是黄芪的主要有效成分，黄芪甲苷为黄芪总皂苷的主要活性指标成分之一[13-14]。熟地和黄精均为多糖类成分[15-16]，蝉花主要为腺苷和多糖成分[17]，其中腺苷为蝉花的主要有效成分，故本实验以黄芪甲苷和腺苷为控制指标对复方健肾颗粒进行质量监控。
　　1 材料与仪器
　　1.1 实验药品与试剂
　　熟地黄对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121196-201105）;制黄精对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121553-201101）;腺苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110879-200202）;硫酸（浙江中星化工試剂有限公司，批号：20140307）;黄芪甲苷对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：11092002）;正丁醇（杭州高晶精细化工有限公司，批号：20100909）;甲醇（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20150620）;乙醇（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20150726）;甲酸（永华化学科技有限公司，批号：20150530）;氨水（浙江中星化工试剂有限公司，批号：20101220）;三氯甲烷（西陇化工股份有限公司，批号：141016）;石油醚（60℃～90℃）（永华化学科技有限公司，批号：141016）;乙酸乙酯（永华化学科技有限公司，批号：20140917）;异丙醇（杭州双林化工试剂厂，批号：20131219）;乙腈（天津市四友精细化学品有限公司，批号：100313）;磷酸二氢钾（湖州湖试化学试剂有限公司，批号：100301）。
　　1.2 实验仪器
　　Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世公司）;Shimadzu高效液相色谱仪（日本岛津公司）;GoodSee-Ⅱ暗箱式薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司）;KQ5200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;JA203H电子分析天平（常州市幸运电子设备有限公司）;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）;HH-4数显恒温水浴锅（常州市幸运电子设备有限公司）。
　　2 方法与结果
　　2.1 性状
　　本品外观大小均匀，颜色呈褐色，味：甜，颗粒流动性好。
　　2.2 鉴别
　　2.2.1 黄芪的薄层鉴别
　　2.2.1.1 对照品溶液的制备  使用甲醇溶液将黄芪甲苷对照品配制成1 mg/mL的对照品溶液。
　　2.2.1.2 供试品溶液的制备  取复方健肾颗粒5 g研成细粉，用50 mL甲醇超声提取30 min，滤过，滤液蒸干。残渣加水10 mL溶解，使用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次需要水饱和正丁醇20 mL，合并正丁醇液，用氨试液再次振摇提取2次，每次需要氨试液20 mL，弃去氨液，收集正丁醇液于蒸发皿中用水浴锅蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。
　　2.2.1.3 阴性对照溶液的制备  取除黄芪外的其余药材，按照处方工艺制成不含黄芪的颗粒，同供试品溶液制备方法操作，制得黄芪阴性样品溶液。
　　2.2.1.4 薄层展开  分别吸取对照品溶液、供试品溶液和缺黄芪的阴性样品溶液，在同一硅胶G薄层板上点样，选择展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液，其中三种溶剂的比例是（13：7：2），将硅胶板放在展开缸中进行展开，展开完成后，取出硅胶板，通风橱中将展开剂风干，在硅胶板上适量喷洒10%硫酸乙醇溶液作为显色剂，加热直至斑点显色清晰，在紫外光灯365 nm下观察薄层板显色现象，结果斑点清晰，圆整，阴性样品无干扰。故可用于复方健肾颗粒中黄芪的薄层鉴别，见封三图2。
　　2.2.2  熟地的薄层鉴别
　　2.2.2.1 对照药材溶液的制备  称取熟地对照药材粉末1 g于锥形瓶中，量取50 mL甲醇作为溶剂超声提取30 min，过滤，滤液置于蒸发皿中于水浴锅上蒸干，残渣加水5 mL使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取，合并正丁醇液，将正丁醇液置蒸发皿中于水浴锅上蒸干，残渣备用。移液枪吸取2 mL甲醇将残渣溶解，作为对照药材溶液。
　　2.2.2.2 供试品溶液的制备  取复方健肾颗粒粉末5 g，按照对照药材溶液相同的处理方法制得供试品溶液。
　　2.2.2.3 阴性对照溶液的制备  按照处方要求称取除熟地外的其余药材，按照复方健肾颗粒的制备工艺制成不含熟地的样品，同对照药材溶液制备方法操作，得到缺熟地的阴性样品溶液，备用。 　　2.2.2.4 薄层展开  分别吸取上述制备的对照药材溶液、供试品溶液和缺熟地的阴性样品溶液，在同一硅胶G薄层板上相应的位置上点样，选择展开剂为环己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下层溶液，展开，将硅胶板从展开剂中取出，通风橱中晾干至硅胶板表面无明显的溶剂残留，置紫外光灯365 nm下观察现象，结果阴性样品无干扰。故可用于复方健肾颗粒中熟地的薄层鉴别，结果见封三图3。
　　2.2.3 黄精的薄层鉴别
　　2.2.3.1 黄精对照药材溶液的配制  取黄精对照药材粉末1 g置于锥形瓶中，使用70%乙醇20 mL，加热回流提取1 h，抽滤，滤液蒸干，用10 mL水将残渣溶解，加正丁醇振摇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，将正丁醇液倒入蒸发皿中于水浴锅上蒸干，残渣备用，用移液枪吸取2 mL甲醇将残渣溶解，作为对照药材溶液。
　　2.2.3.2 供试品溶液的制备  取复方健肾颗粒粉末5 g，按照对照药材溶液相同处理方法制得供试品溶液。
　　2.2.3.3阴性样品溶液的制备  按照已确定的处方取除黄精外的其余药材，按照复方健肾颗粒的制备工艺制成不含黄精的颗粒，同供试品溶液相同的处理方法，制备缺黄精的阴性样品溶液。
　　2.2.3.4 薄层展开  吸取上述对照药材溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，在同一硅胶G薄层板上点样，将石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸=（5：2：0.1）的溶液做为展开剂，展开，取出，晾干，喷以适量5%香草醛硫酸溶液作为显色剂，加热至斑点显色清晰，日光灯下观察薄层显色现象，结果阴性样品无干扰，故可用于复方健肾颗粒中黄精的薄层鉴别，结果见封三图4。
　　2.2.4 蝉花的薄层鉴别
　　2.2.4.1 对照品溶液的制备  取腺苷对照品，加甲醇制成2 mg/mL腺苷的溶液，作为对照品溶液。
　　2.2.4.2 供试品溶液的制备  取复方健肾颗粒5 g置于锥形瓶中，将其用50 mL甲醇作为溶剂超声提取30 min，将提取液过滤，滤液蒸干，残渣用10 ml水进行溶解，使用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次需要水饱和正丁醇液20 mL，收集正丁醇液，于蒸发皿中在水浴锅中蒸干，残渣备用。移液枪吸取甲醇2 mL将残渣溶解，作为供试品溶液。
　　2.2.4.3 阴性样品溶液的制备  取除蝉花外的其余药材，按照复方健肾颗粒的制备工艺制成不含蝉花的颗粒，按照供试品溶液同样的处理方法，制备蝉花阴性样品溶液。
　　2.2.4.4  薄层展开  吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5 μL，在同一硅胶GF254薄层板上点样，以氯仿-醋酸乙酯-异丙醇-水-浓氨水（5：2：6：0.6：0.13）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254 nm下检视，结果阴性样品在同样的位置无斑点，故可用于复方健肾颗粒中蝉花的薄层鉴别。结果见封三图5。
　　2.3 检查
　　2.3.1粒度  分别取3批样品各3袋，按《中国药典》2010年版一部附录XIB第二法双筛分法测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的颗粒和粉末总和均小于15%，结果符合规定。测定结果见表1。
　　表1   3批样品粒度检查结果（n=3）
　　2.3.2 水分  分别取3批样品各3袋，按《中国药典》2010年版一部附录IXH水分测定法第一法（烘干法）检查，取供试品2～5 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，打开瓶盖在100℃～105℃干燥5 h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量，计算供试品中的含水量（%）。规定水分不得超过6.0%。测定结果见表2。
　　2.3.3 溶化性  分别取3批样品各3袋，加热水200 mL，搅拌5 min，立即观察，颗粒剂应全部融化，允许有轻微浑浊。符合《中国药典》2010年版一部的要求。结果见表3。
　　2.3.4 装量差异  分别取3批样品各3袋，按《中国药典》2010年版一部附录颗粒剂项下检查，分别称定每袋内容物的重量，每袋装量与标示装量相比较，超出装量差异限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍。结果见表4。
　　表4   3批样品装量差异结果（n=3）
　　注：结果表明3批样品装量差异均小于士5%，符合药典规定
　　2.4 含量测定
　　2.4.1 黄芪甲苷含量测定
　　2.4.1.1 对照品溶液的制备  将黄芪甲苷用甲醇溶液配制成0.54 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。
　　2.4.1.2  供试品溶液的制备  取自制复方健肾颗粒10 g，研钵研磨成细粉，混合均匀。称取细粉5 g，置于锥形瓶中，选择100 mL甲醇作为提取溶剂，先进行浸泡提取，提取时间2 h，再加热回流提取，提取时间1 h。将提取液滤过，滤液蒸干，将蒸干后的物质用10 mL水溶解，再依次用水饱和正丁醇和氨试液洗涤，保留的正丁醇液于蒸发皿中用水浴蒸干，残渣加水10 mL使溶解，放冷后将样品过D101大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），分别用水、40%乙醇、70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液置于蒸发皿中用水浴锅蒸干，残渣备用。用移液枪量取少量甲醇将残渣溶解后转移至5 mL容量瓶中，使用甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液[18-20]。
　　2.4.1.3 标准曲线的绘制  分别精密移取黄芪甲苷对照品溶液，进样量范围设置为：5～17.5 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以黄芪甲苷进样量（μg）的对数值为横坐标（X），峰面积的对数值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程为log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，表明其在2.70～9.45 μg內线性关系良好。 　　2.4.1.4  精密度试验  将2.4.1.1 下配制的黄芪甲苷对照品溶液精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，计算峰面积，连续进样6针，RSD为2.82%，表明本仪器的精密度良好。
　　2.4.1.5 重复性试验  按照复方健肾颗粒的处方工艺制备成6批颗粒，按照供试品溶液相同的方法进行处理，制备样品溶液。设置进样的样品量为10 μL，每份样品均进样1次。注入液相色谱仪，计算色谱峰面积，RSD为1.79%，表明本实验使用的方法制备的黄芪甲苷重复性良好。
　　2.4.1.6 稳定性试验  精密吸取2.4.1.2项制备的黄芪甲苷供试品溶液20 μL，在24 h内不同的时间点将对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录各时间点的峰面积，RSD为2.21%，表明复方健肾颗粒溶液中黄芪甲苷在24 h内稳定。
　　2.4.1.7 加样回收率试验  精密吸取2.4.1.2项制备的供试品溶液，取6份于6个容量瓶中，分别加入黄芪甲苷对照品溶液0.27 mg，摇匀，用甲醇溶液定容至刻度，将样品用0.45 μm微孔滤膜过滤，6份溶液各均取过滤后的样品7.5 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，结果可知黄芪甲苷的平均加样回收率为100.45%， RSD值为2.81%，表明该方法稳定可行。结果见表5。
　　2.4.1.8 复方健肾颗粒中黄芪甲苷含量测定  取自制的复方健肾颗粒3批（20151116～20151118），均按照供试品溶液的操作方法处理复方健肾颗粒，精密吸取适量样品溶液（在标准曲线范围内的量）注入液相色谱仪，记录色谱图，根据标准曲线计算黄芪甲苷含量为0.0445%。考虑到各种外界因素会影响含量，含量限度规定是均值的80%，故本实验暂定复方健肾颗粒中黄芪甲苷含量限度为0.0356%。结果见图1、图2、表6。
　　2.4.2 腺苷含量测定  本课题采用HPLC测定蝉花药材及复方健肾颗粒中腺苷的含量，色谱条件如下：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（5 μm，150×4.6 mm）;流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液;甲醇=90：10;检测波长：260 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;进样量：20 μL。
　　2.4.2.1 对照品溶液的配制  精密称取腺苷标准品1.57 mg至25 mL容量瓶中，用10%甲醇溶解，定容，摇匀，制备成62.8 μg/mL的对照品溶液作为母液。
　　2.4.2.2 供试品溶液的配制  精密称取复方健肾颗粒1 g于锥形瓶中，加入10%甲醇20 mL，称重，超声处理30 min，用10%甲醇补足重量，摇匀，过滤，用0.452 μm微孔滤膜过滤，即为样品溶液[21-22]。
　　2.4.2.3 标准曲线绘制  分别从母液中移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，使用10%甲醇定容，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以腺苷峰面积A对浓度C（μg/mL）进行线性回归。回归方程为：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，表明腺苷在0.628～7.536 μg/mL峰面积与浓度线性关系良好。
　　2.4.2.4精密度    取2.4.2.1项下对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，高效液相色谱仪设置进样6针，记录峰面积，RSD为2.18%，表明精密度良好。
　　2.4.2.5 重复性  精密称取复方健肾颗粒1 g，平行6份，加入10%甲醇20 mL，称重，超声处理30 min，用10%甲醇补足重量，摇匀，过滤，取20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，RSD为2.14%，表明重复性良好。
　　2.4.2.6 稳定性  取2.4.2.5项下溶液同法操作在第0、1、2、3、4、5、6 h时间内测定供试品溶液的峰面积，RSD为2.63%，表明腺苷在6 h内比较稳定。
　　2.4.2.7 加样回收率试验  取已知含量的复方健肾颗粒溶液9份至5 mL容量瓶中，分别加入供试品溶液的80%、100%、120%的标准品溶液，滴管吸取10%定容至刻度，摇匀，设置进样量为20 μL，将样品注入液相色谱仪，计算平均回收率为97.71%，RSD为1.95%。结果见表7，可知加样回收率符合要求。
　　2.4.2.8 复方健肾颗粒中腺苷含量测定  取复方健肾颗粒1 g，平行3批，精密称定，加入10%甲醇20 mL，称重，超声提取30 min，用10%甲醇补足重量，摇匀，过滤，0.45 μm微孔滤膜过滤，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，根据标准曲线计算腺苷含量为0.00627%。考虑到各种外界因素作用会导致含量变化，含量限度规定是均值的80%，故本实验暂定复方健肾颗粒中腺苷含量限度为0.005%。结果见图3、图4、表8。
　　3讨论
　　薄层点样时，需要用铅笔划定供试品溶液、对照药材或对照品溶液，阴性对照溶液的点样位置，在划定过程中不要太用力，防止破坏硅胶，影响点样效果。薄层色谱展开时，需要将展开剂于展开缸预饱和20～30 min，点样时应使斑点尽可能小，并且每次点样尽可能在同一位置，需要做到多次少量点样的原则，也可使用外界工具如吹风机或者洗耳球使样品溶液在短时间内挥干，薄层板置于展开缸中饱和30 min后再上行展开。在喷洒显色剂的过程中，显色剂的量太少，则斑点显色不清楚。若显色剂的量过多，硅胶板容易出现碳化现象，故显色剂需适量。
　　在黄芪甲苷的供试品处理过程中，多次需要使用水饱和正丁醇进行振摇提取，需要注意振摇不要太剧烈，防止发生乳化现象。
　　在黄芪的薄层鉴别时，点样量为10～20 μL時，斑点出现偏移，后改为5 μL，薄层展开效果较好，符合要求。 　　在蟬花薄层鉴别时，曾用含4%磷酸氢二钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂自制硅胶GF254薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（12：6：3：3：1） 为展开剂，由于展开效果不理想，后改为市售GF254板，分别以展开系统1：环己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下层液和展开系统2：正己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（2：11：1：5：2）的下层液进行展开，根据展开效果最终确定展开系统1为展开剂。
　　对于复方健肾颗粒的质量控制研究中，使用HPLC-ELSD对黄芪甲苷进行定量测定，方法精密度高、准确度好，能够对黄芪甲苷的含量准确测定;同时使用了薄层色谱法鉴定黄芪甲苷，方法可行。使用HPLC-UV对蝉花腺苷进行定量测定，方法学重复性好，加样回收率符合要求，能够对腺苷含量进行高效、准确测定;使用薄层色谱法鉴定腺苷成分，斑点清晰圆整，可用于腺苷的定性测定。本实验同时使用薄层色谱法和高效液相色谱法同时对黄芪甲苷以及腺苷进行测定，质量评价方法准确且完善。
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　　（收稿日期：2019-10-11）
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