早期异位妊娠母体血清Netrin-1检测的意义分析

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　　【摘要】 目的 探讨早期异位妊娠母体血清Netrin-1检测的临床意义。方法 选取拟诊早期异位妊娠患者100例作为实验组， 另选取同期要求终止妊娠的宫内早孕患者100例作为对照组。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂检测两组患者母体血清Netrin-1表达水平。比较两组患者Netrin-1表达水平， 分析Netrin-1诊断早期异位妊娠临床诊断阈值。结果 实验组患者Netrin-1表达水平为（80.84±8.66）pg/ml， 显著低于对照组的（353.00±9.96）pg/ml， 差异有统计学意义（P<0.05）。Netrin-1浓度诊断早期异位妊娠的受试者工作特征曲线（ROC）曲线下面积的95%可信区间为（0.911， 0.977）。据Youden’s index计算Netrin-1临床诊断阈值为226.50 pg /ml， 即Netrin-1浓度≤226.50 pg /ml考虑早期异位妊娠可能性大。结论 早期异位妊娠患者血清Netrin-1表达显著降低， 考虑可能与异位妊娠患者绒毛血管形成受阻有关。
　　【关键词】 Netrin-1;早期异位妊娠;血清
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.08.087
　　【Abstract】 Objective   To investigate the significance of Netrin-1 detection in maternal serum of early ectopic pregnancy. Methods   There were 100 cases of early ectopic pregnancy selected as the experimental group and another 100 cases of early intrauterine pregnancy requiring termination of pregnancy as the control group. The expression of Netrin-1 in maternal serum of the two groups was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression level of Netrin-1 was compared between the two groups， and the clinical diagnostic threshold of Netrin-1 in the diagnosis of early ectopic pregnancy was analyzed. Results   The expression level of Netrin-1 in the experimental group was （80.84±8.66） pg/ml， which was significantly lower than （353.00±9.96） pg/ml in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The 95% confidence interval of the area under the receiver operating characteristic （ROC） curve for subjects with Netrin-1 concentration in the diagnosis of early ectopic pregnancy was （0.911， 0.977）. According to Youden’s index， the clinical diagnosis threshold of Netrin-1 was 226.50 pg/ml， that was， the concentration of Netrin-1 ≤226.50 pg/ml was very likely to consider early ectopic pregnancy. Conclusion   The expression of Netrin-1 in serum of patients with early ectopic pregnancy was significantly decreased， which may be related to the obstruction of villous angiogenesis in patients with ectopic pregnancy.
　　【Key words】 Netrin-1; Early ectopic pregnancy; Serum
　　隨着社会的发展， 不孕症患者日益增多， 相应导致辅助生殖技术的应用亦相应增多， 从而异位妊娠发生率相应升高。此外， 由于目前二胎政策的放开， 保留生殖能力日益引起人们的重视， 早期异位妊娠（ectopie pregnancy）（孕4～5周）保守治疗治愈率高， 再生育率增加。因此目前早期异位妊娠的确诊尤显重要。由于早期异位妊娠临床表现不明显， 诊断较困难， 在诊断不明的情况下是继续维持先兆流产的保胎方案， 还是采用异位妊娠的诊疗措施， 临床工作中存在较大争议， 从而导致异位妊娠患者终止妊娠时孕周偏大， 使得临床上保守治疗效果减弱。在胚泡着床过程中， 滋养细胞会产生一定相关血管新生因子维持妊娠[1]。Netrin-1作为一种血管新生因子， 可调节胚胎生长发育。在早期绒毛血管生成和早期胚胎停止发育的发病中Netrin-1家族成员可能也起到一定的作用[2]。据此， 本研究拟通过获取患者孕早期血清Netrin-1水平确定早期异位妊娠， 从而提高保守治疗效果， 提高患者再生育率。现报告如下。 　　1 资料与方法
　　1. 1 一般资料 选择2016年5月～2018年5月就诊于本院妇科门诊的拟诊早期异位妊娠患者100例作为实验组， 另选择同期要求终止妊娠的宫内早孕患者100例作为对照组。本实验经本院伦理委员会批准， 所有患者均签署知情同意书。纳入标准：此次妊娠前月经周期规律， 末次月经准确， 无内分泌及肿瘤病史， 妊娠后未服用影响胎儿发育的药物， 无遗传疾病， 慢性疾病及传染病的健康女性;排除标准：妊娠前及妊娠期有宠物接触史， 孕母有吸烟、酗酒及吸毒史， 多胎妊娠。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。见表1。
　　1. 2 标本的采集与制备 所有患者入组后抽取母体血检测Netrin-1水平， 离心后血清留置于-80℃冰箱中， 待标本收集至少至20份后进行检测， 所有血清标本均在3个月内检测完毕， 其中Netrin-1水平ELISA试剂采用Human netrin-1 （Ntn1）ELISA Kit （CUSABIO， 美国）， 检测仪器采用雷杜 Rayto 酶标仪检测。按照常规ELISA试剂检测步骤进行检测。ELISA试剂盒操作步骤：实验开始前， 提前配置好所有试剂， 试剂或样品稀释时均需混匀， 混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时用样品稀释液进行稀释， 以使样品符合试剂盒的检测范围。①加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl， 余孔分别加标准品或待测样品100 μl， 注意不要有气泡， 加样将样品加于酶标板孔底部， 尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀， 酶标板加上盖或覆膜， 37℃反应120 min。②弃去液体， 甩干， 不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100 μl（取1 μl生物素标记抗体加99 μl生物素标记抗体稀释液的比例配制， 轻轻混匀， 在使用前1 h内配制）， 37℃， 60 min。③温育60 min后弃去孔内液体， 甩干， 洗板3次， 浸泡1～2 min/次， 350 μl/孔， 甩干。④每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100 μl， 37℃， 60 min。⑤温育60 min后弃去孔内液体， 甩干， 洗板5次， 浸泡1～2 min/次， 350 μl/孔， 甩干。⑥依序每孔加底物溶液90 μl， 37℃避光显色。⑦依序每孔加终止溶液50 μl， 终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性， 底物反应时间到后应尽快加入终止液。⑧用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15 min以内进行检测。
　　1. 3 观察指标 比较两组患者Netrin-1表达水平， 分析Netrin-1诊断早期异位妊娠临床诊断阈值。
　　1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验;Netrin-1临床诊断阈值采用ROC曲线下面积性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。使用Graphpad Prism 5.0进行作图分析。
　　2 结果
　　2. 1 两组患者Netrin-1表达水平比较 实验组患者Netrin-1表达水平为（80.84±8.66）pg/ml ， 显著低于对照组的（353.00±9.96）pg/ml， 差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
　　2. 2 Netrin-1诊断早期异位妊娠临床诊断阈值    Netrin-1浓度诊断早期异位妊娠的ROC曲线下面积的95%可信区间为（0.911， 0.977）。据Youden's index计算Netrin-1临床诊断阈值为226.50 pg/ml， 即Netrin-1浓度≤226.50 pg /ml考虑早期异位妊娠可能性大。
　　3 讨论
　　异位妊娠是指受精卵在子宫体腔以外着床的妊娠， 是妇科常见的急腹症， 未及时救治会影响患者预后， 严重地会导致孕妇死亡。随着流行病学变化及诊断技术的提高， 目前异位妊娠发病率呈逐渐升高及年轻化趋势[3， 4]， 如何提高早期异位妊娠诊断率， 尤其是对于需保留输卵管的孕妇， 减少对女性身心健康损害是目前妇产科医师必须面临的一个重要课题。
　　最近研究发现， Netrin-1及其受体在脊椎动物的肺、乳腺、胰腺和血管上皮中均有表达， 参与组织器官的维持及发展;进一步研究发现， Netrin-1从属于Netrins家族， Netrins是一种与层粘蛋白相关的蛋白家族， 在进化过程中具有高度保守性[5]。相关研究[6]表明， Netrin-1是一种分泌与轴突生长和迁移有关的蛋白质， 其在血管生成及中枢神经系统发育过程中起关键作用。从解剖学和细胞水平来看， 血管和神经系统的发生过程具有一定的相似性， 都是多分枝和高度复杂的网络。在早孕期间， 胚泡植入后， 细胞滋养细胞便开始不断增生、融合及侵袭血管， 形成绒毛， 绒毛生长的过程中伴随着血管的新生， 新生血管发生过程与滋养细胞及内皮细胞功能密切相关， 并受到血管新生因子的调节， 其中包括了Netrins。研究证实Netrin-1与促进胎盘血管形成及胎盘着床位置有关[1， 6， 7]， 同时亦可影响胚胎的活力。研究发现[8， 9]， Netrin-1能促进人绒毛膜外滋养细胞的增殖和侵袭能力。王珺等[2]研究发现， Netrin-1低表达与胚胎停止发育有关。本研究结果中， 实驗组患者Netrin-1表达水平为（80.84±8.66）pg/ml ， 显著低于对照组的（353.00±9.96）pg/ml， 差异有统计学意义（P<0.05）。与文献报道一致。Netrin-1浓度在诊断异位妊娠及宫内早孕的ROC曲线下面积95%可信区间为（0.911， 0.977）， Netrin-1临床诊断阈值为226.50 pg/ml， 与临床诊断相符合， 但因为该研究中样本量为200例， 样本量较小， 此外， 有部分宫内早孕及早期异位妊娠停经时间短， 部分宫内早孕超声下未见卵黄囊及部分早期异位妊娠还没有超声异位妊娠部位的改变， 因此， 利用Netrin-1浓度来进行早期异位妊娠的临床诊断可能会有一定误差及偏倚， 在提高诊断阈值方面尚需大样本研究来提高早期异位妊娠诊断率。 　　综上所述， 胚泡着床及妊娠的维持受到了Netrin-1的调节， 当Netrin-1水平降低， 滋養细胞功能受损， 绒毛血管发生障碍， 异位妊娠发生可能性加大。
　　参考文献
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　　[8] 杨昀， 王勇， 杜燕， 等. 轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用. 中华妇产科杂志， 2009， 44（2）：131-134.
　　[9] 钟少平， 沈华祥， 刘霞， 等. 可溶性Netrin-1受体对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响. 浙江医学， 2013， 35（3）：159-162.
　　[收稿日期：2020-01-02]
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