肛瘘实验模型研究进展

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　　【摘要】 为了更好地通过动物实验评价不同肛瘘术式的疗效，不同时段的研究者试图应用不同的动物制作瘘管模型，目前世界范围内更为大众认可的是猪肛瘘模型，肛瘘造模的实现推动了肛瘘治疗方法的基础性研究。本文着重综述不同时期、不同动物肛瘘模型的操作方法及实验成果。
　　 【关键词】 肛瘘; 动物模型; 研究进展
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.25.076 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）25-0-03
　　 Progress in Experimental Models of Anal Fistula/ZHOU Shouqun，HUANG Yanlan.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（25）：-183
　　 【Abstract】 In order to better evaluate the effect of different anal fistulas’ operations by animal experiments，researchers at different times tried to use different animal to make fistula models.Currently，the anal fistula model of pig is most accepted in the world.The realization of anal fistula models promotes the basic research of anal fistula treatment.The article focus on reviewing the manipulation methods and experimental results of anal fistula models in different periods and animals
　　 【Key words】 Anal fistula; Experimental model; Research progress
　　 First-author’s address：The Third People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China
　　 肛瘘的治疗方法有多种，术后复发或引起肛门不同程度失禁的情况不尽相同。目前为止，仍未有一理想的术式可用于治疗所有的肛瘘，在临床治疗方面仍然存在争议。因此，研究者在探索肛瘘（尤其是复杂、高位肛瘘）的治疗方法上投入大量的精力，试图研究出尽可能小的损伤肛门功能的技术。外国文献[1-5]中提到的纤维蛋白胶法或皮瓣推移法等，经临床试验发现，术后复发率较高，目前国内鲜少应用。这些新颖的治疗方法是否可以通过动物实验优化呢？前提是有一个合理的、成熟的肛瘘实验模型[6]。为此，科研人员付出诸多努力，将成果综述如下。
　　1 肛瘘模型的建立
　　1.1 造模动物
　　1.1.1 狗 早在1967年，Mccoll等[7]就试图用狗制作肛瘘的实验模型，为了模拟肛瘘的病机，通过结扎探查到肛腺的出口，观察其发展为肛瘘的可能性，但没有找到瘘管。尽管该实验中还局部注入大肠杆菌，也仅有腺体感染的征象（该类腺体与肛门括约肌内腺体相似）。Mccoll等[7]认为实验选错了肛腺，与他们发现的腺体相比，狗的肛瘘发病与肌肉内腺体的发病关系更大，所以人工造瘘没有成功，但这样的实验设计却最接近肛瘘的发病机理。
　　1.1.2 猪 首次肛瘘造模的失败，并没有影响进一步实验研究的步伐，Buchanan等[8]第一次应用猪制作肛瘘的实验模型，该实验一共选取8只猪，每只猪的肛门部应用引流线制作3个瘘管，一共24个瘘管。引流26 d后，所有的猪在麻醉下行“盆底MRI”检查，后拆除引流线，并进行临床及微生物学分析，2只猪被安乐处死后，取肛门部组织用于瘘管的病理组织学分析（共有6个标本）。Buchanan等首次從MRI、细菌培养分析及病理组织学多个角度证实了肛瘘造模的成功。这一模型后期被用于研究不同肛瘘治疗方式的疗效。目前，猪的肛瘘模型是世界范围内最为大众认可、最常被应用的。
　　1.1.3 鼠 虽然猪的模型已经取得成功，并应用于各项研究，但Arikaki等[9]再次尝试应用鼠进行肛瘘造模。该实验一共选取10只鼠，应用钢丝引流的方法在鼠的肛门部穿过肛门括约肌组织制作肛瘘，同样通过病理来证实瘘管的形成及特点。10个样本病理学上均证实存在肉芽组织包绕的肛瘘管腔，其中2例样本的瘘管完全上皮化，1例样本的瘘管50%上皮化，6例样本的瘘管仅外口处上皮化，另1例样本的瘘管上皮化不明显。Arikaki等[9]首次发现了人工肛瘘的上皮化。同时，他们认为鼠尺寸较小且拥有与人类相似的内外括约肌结构，制瘘过程操作简单、方便，是一个实用的动物模型。
　　1.2 制瘘过程及取材
　　1.2.1 猪 8只猪均在麻醉下造瘘。取膀胱截石位，在3、9、12点位距肛缘2 cm处作一小切口，（没有选择6点位是因为考虑到其接近尾骨，可能通过脊髓诱发败血症），在每一切口处，以14号单腔导管自切口处通过肛门周围括约肌组织穿至齿线处，并穿透齿线处黏膜，引流线在导管的引导下穿过，后移除导管，使引流线呈虚挂状态[8]。3个位置的瘘管采取不同材质的引流线，分别使用硅胶管，聚酯编织线，尼龙线。观察、喂养26 d后，8只猪在麻醉状态下行MRI检查，检查完后拆除引流线，同时收集三个部位的细菌培养标本进行培养。细菌培养标本分别采集于肛管内、会阴部及每个瘘管内，共40个标本。为避免采集瘘管内标本时被肛管内细菌污染，标本是在外口处采集的。病理取材：2只猪安乐处死后，获取肛管直肠的病理标本，剩余的6只猪用于进一步的实验研究，从6点位着手，用电刀切除标本，上达直肠中段，前缘达会阴部，两侧包含瘘管的边缘组织[10]。最终Buchanan得出结论：（1）病理组织学分析发现初步形成的、有着类似肛腺结构的肛门内括约肌;6个病理标本检查均发现有瘘管管腔，及与人类瘘管相似的丰富的肉芽组织，但瘘管的上皮化不明显。（2）MRI结果均显示高位的、单一的瘘管管道。（3）瘘管、会阴部、肛内3处取材的细菌标本培养结果发现，瘘管的菌群与粪便菌群更接近，而非肛周皮肤菌群。 　　1.2.2 鼠 麻醉后，取仰卧位，四肢外展固定，无菌操作，5号螺纹钢丝自肛门左侧约1 cm处穿过肛门括约肌，在穿透皮肤后，取合适的长度，旋转固定，使之围绕肛门括约肌呈虚挂状态[9-11]。病理取材：30 d后，用手术刀沿肛门环形、完整切除肛周组织，包含会阴部及人造瘘管的边缘组织及直肠，切除的组织经过切片、染色进行病理组织学分析，通过观察管腔的内外口、完整管腔结构、包绕管腔的肉芽组织及上皮化区域判断鼠的人造肛瘘是否存在。
　　2 不同造模的对比分析
　　 目前，研究认为肛瘘的发生是因肛腺感染引起，而肛腺开口堵塞是感染发生的原因。虽然Mccoll等的实验模型最终失败，但他们的设计方法是最接近肛瘘的发病机制的。Buchanan的实验模型在制瘘时明确提出引流线肛管部分是穿透齿线处的。而Arikaki等则没有确切描述引流线的位置。因此，猪实验模型更为严谨，更有说服力。
　　 Buchanan、Arikaki等都从病理学上证实了瘘管的存在，前者制瘘后观察26 d，后者观察30 d，Buchanan发现的瘘管均无上皮化，而Arikaki等发现的瘘管90%上皮化，那么上皮化是否跟引流时间、引流线的材质（二者采用同材质的引流线）等有关，如果延长实验时间，是否所有的瘘管均会上皮化。因为临床中瘘管的发生多是慢性进展，而上述实验中均属急性期肛瘘，为了更符合临床，瘘管需要引流更长的时间。
　　 Buchanan的实验还采集了24个瘘管的细菌标本，其中20个培养出粪便内的细菌，证实瘘管的菌群与粪便细菌关联性更大，即说明瘘管的感染源来自肛管内，进一步证实了腺源性学说。
　　3 肛瘘造模的意义
　　 临床上，想要通过手术获取完整的瘘管进行病理分析很困难，但动物实验则可以实现，所以制作出一种肛瘘实验模型具有重要的意义。十余年来，许多新颖的、创伤小的肛瘘术式，如纤维蛋白胶法、皮瓣推移法、LIFT术式、肛瘘镜术式等在临床中不断地推广、应用，发现该类术式复发率较传统术式高。学者们试图通过进一步的实验研究优化这一类的术式，而肛瘘造模的成功，为研究微创术式的疗效及预后奠定了基础。
　　 国内马木提江·阿巴拜克热等[12-14]也进行过研究，应用长白猪建立肛瘘模型，成功率分别达83.33%（单纯性肛瘘）、75.00%（复杂性肛瘘）;谢昌营等[15]应用大鼠制作肛瘘模型，并用于研究肛门洗剂促进创面愈合的原理;王琛等[16-17]实验在大鼠的体表造瘘，严格意义上不属于肛瘘实验模型，因为瘘管与肛门无相关性，但同样推动了各类中药制剂促进瘘管愈合的机理研究。王鑫等[18-23]研究不同肛门洗剂对瘘管愈合的影响及作用机制;闵丽等[24-25]结合中医证型建立模型，中医认为淫毒侵犯，引起脏腑阴阳失调，营卫气血瘀滞，邪浊阻塞经脉而致“瘘”。故“正虚邪恋型”是临床上瘘管最常见的证型，通过采用腹腔注射环磷酰胺联合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液注入弹簧纱条的方法，成功制备出稳定的、可重复的正虚邪恋型体表瘘管大鼠模型。
　　 目前，世界范围内较为公认的是猪肛瘘模型，随着实验模型的发展，其应用于评估肛瘘不同术式的研究也越来越多，为难治性肛瘘筛选愈合快、复发率低、创伤小的治疗方法。如Han等[26-28]提出的脱细胞真皮基质、自体成纤维细胞及药线疗法。实验研究往往能突破临床研究的瓶颈，希望通过进一步的、深入的实验研究，肛瘘的微创术式能够得到优化，为临床治疗高位、复杂性肛瘘患者带来福音。
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　　（收稿日期：2019-04-10） （本文编辑：李盈）
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