过敏性哮喘中医证候模型研究进展及评价

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　　 摘要：本文通过查阅近年来国内外过敏性哮喘中医证候模型相关研究文献，对阴虚证、气虚证、寒证、热证哮喘中医模型造模方法及评价标准进行归纳，认为中医理论指导下的动物证候模型基本符合中医辨治特点，可为研究与应用提供参考。但其致病因素、病因病机与发病转归等与临床实际仍存在差异，需进一步探索。
　　 关键词：过敏性哮喘;中医;证候模型;综述
　　 中图分类号：R256.12    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）08-0133-04
　　 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.029      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　 Abstract： By reviewing the relevant research literature about TCM syndrome models of allergic asthma in recent years， this article summarized the TCM modeling methods and evaluation criteria of yin deficiency syndrome， qi deficiency syndrome， cold syndrome and heat syndrome asthma， argued that the animal syndrome models under the guidance of TCM theory basically conformed to the characteristics of TCM differentiation and treatment， and could provide references for research and application. However， pathogenic factors， etiology and pathogenesis， and onset and development of allergic asthma are still different from clinical practice and need further exploration.
　　 Keywords： allergic asthma; TCM; syndrome models; review
　　 過敏性哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，发病机制复杂，与多达100种以上的遗传位点和复杂环境因素有关[1]，为多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、B细胞、平滑肌细胞）和细胞组分参与的气道炎症反应[2]。过敏性哮喘可归属中医学“哮证”范畴，以发作时喉中哮鸣有声、呼吸困难，甚则喘息不得平卧等为主要表现，然哮必兼喘，故将“喘病”与“哮证”合并为哮喘，认为其发作与六邪侵袭、痰阻气道、肺失宣发、脾失水运、肾气化失司有关。笔者通过查阅近年来国内外过敏性哮喘中医证候模型相关研究文献，结合现代药理研究，对近年中医模型造模方法及评价标准进行归纳，为研究与应用提供参考。
　　1  模型动物选择
　　 用于建立过敏哮喘模型的动物以啮齿类动物居多，如豚鼠，129Sv、A/J、BALB/c和C57BL/6小鼠，BN、Wistar和SD大鼠，此外还有犬、羊及其他动物，豚鼠是最早开展模型的动物选择，但由于个体反应差异大，给药后经常会出现无哮喘反应或发生急性过敏性休克的情况，犬、羊等大型动物一般用于蛔虫卵抗原的自然致敏，但品系选择困难，难保纯正，且研究费用高操作困难，故目前实验选择上逐渐被小鼠或大鼠所替代[3]。不同小鼠和大鼠各自不同品系对不同的反应源趋于敏感。小鼠品系中，129Sv小鼠对卵清白蛋白（OVA）及呼吸道合胞病毒反应性更强，A/J小鼠对抗原注射的免疫应答良好，BALB/c小鼠易产生针对OVA和花粉的气道高反应性，C57BL/6小鼠容易诱发免疫耐受性，对尘螨和豚草抗原反应性较强[4]。大鼠品系中，BN大鼠模型在特异性抗体的产生及诱发哮喘症状上具有明显优势[5]，SD大鼠和Wistar大鼠的遗传背景相似，为国内研究常用模型，SD大鼠对疾病的抵抗力优于Wistar大鼠，尤其在呼吸道疾病方面。但相同条件复制哮喘模型成功率Wistar大鼠优于SD大鼠[6]。因此，建立过敏性哮喘中医证候模型可根据辨证分型选择所需模型，合理选择模型动物品系。
　　2  中医模型建立与评价
　　2.1  阴虚证模型
　　 阴虚证指阴液不足或亏损而无法制阳导致虚热内生的一种证候。中医学认为，阴虚者多有心烦意乱、焦躁不安、毛发无光泽、大便干结、小便发黄、口干咽燥症状。甲状腺激素过多导致的发病虽然病情初起多实，但病久则虚，伴心跳过快、情绪容易激动、皮肤粗糙、食欲亢进、体质量减轻等症状，与阴虚证症状相似，故实验研究常用甲状腺素片灌胃造模法[7]、甲状腺素注射造模法[8]、甲状腺素联合利血平造模法[9]等。虽也有学者用糖皮质激素造模，但造模后动物的行为学表现与中医阴虚证不甚相符，故不常用。
　　2.1.1  造模与给药
　　 王志旺等[10-11]选择BALB/c小鼠，采用OVA致敏、灌胃甲状腺素复制阴虚型哮喘模型。第1日、第8日在腹腔及背部皮下注射致敏液（抗原：OVA，佐剂：氢氧化铝生理盐水混悬液），第15日起将小鼠置于雾化系统中加入OVA激发液使小鼠吸入20 min，隔日1次，连续28 d。第29日起予甲状腺片药液灌胃，每日1次，连续14 d。杨婧等[12]选择SD大鼠，采用卵清蛋白致敏、地塞米松干预复制阴虚哮喘模型。第1、7日在腹腔、两侧后足跖、腹股沟、腰、背、颈部注射不同剂量致敏液（抗原：OVA，佐剂：氢氧化铝溶液），第14日起将大鼠置于雾化箱中雾化吸入15 min，每日1次，连续21 d。在此基础上每日注射大剂量地塞米松，同时每周2次予OVA生理盐水溶液雾化吸入，连续2周，至第48日。 　　2.1.2  评价指标
　　 结合中医临床阴虚患者症状指标，阴虚模型动物有多饮多食、小便发黄、大便干燥、体质量增长缓慢、形体毛发粗糙等症状。采用病理学水平检测cAMP、cGMP及其平衡方面，评价机体机能虚性亢奋状态;激发哮喘症状的行为学反应，观察有无腹式呼吸、抓耳挠腮的动作及皮肤出现紫绀;哮喘病理学检测对肺组织进行称湿重、干重及二者比值可判断肺脏是否处于精血津液不足的虚损状态[11]，HE染色观察肺组织炎症浸润程度，ELISA检测肺泡灌洗液中不同种类白细胞介素及其对应水平等[13]。
　　2.2  气虚证模型
　　 哮证的产生一方面因宿痰伏肺，痰阻气道，气道挛急，肺失肃降，肺气上逆导致痰鸣气喘，一方面因脾气不足无法运化水湿，津液凝聚成痰伏藏于肺内。然肾为人体先天之本，哮证日久不愈，久则伤肾，肾气损伤，病情加重。因此实验研究气虚证模型时应考虑肺、脾、肾多脏器对哮喘的影响，从不同的辨证角度进行动物造模。
　　2.2.1  造模与给药
　　 刘莹等[14]选择Wistar大鼠，根据“恐则气下，劳则气耗”的中医理论采用OVA致敏及外部刺激方法复制肾气虚哮喘模型。第1、8日腹腔注射OVA致敏液，与此同时，从第1日起连续于上午同一时间将大鼠放置在安静房间内放送有猫叫声的录音进行惊恐刺激，每次10 min，同时用梅花针叩击大鼠模拟猫抓拿攻击大鼠的情景，下午在尾根部缠绕质量约为10%体质量的保险丝，放入水槽中游泳，以力竭为度（大鼠鼻尖没入水面10 s），每日1次，共14 d。第15日起将大鼠置于雾化缸内，以OVA超声雾化吸入30 min诱导哮喘，每日1次，直至处死。孙丽平等[15]选择KM小鼠，采用灌胃大黄煎剂后OVA致敏方法复制脾气虚哮喘模型。第1日起予大黄煎剂灌胃，每日1次，连续7 d。脾气虚造模3周后起腹腔注射OVA致敏液，致敏后第15日将小鼠置于雾化缸，以OVA溶液雾化激发哮喘，每次30 min，每日1次，连续11 d。李泽庚等[16]选择豚鼠，对哮喘模型加以改良复制肺气虚哮喘模型。在第1、10、20日腹腔注射OVA及0.9%氯化钠注射液，第30日起将豚鼠放置于雾化箱，使其吸入OVA，持续10 d，所有豚鼠保持自然通风通气15 min，每日2次。
　　2.2.2  评价指标
　　 肾气虚、脾气虚、肺气虚哮喘共有检测指标为动物哮喘激发时的行为学反应（躁动不安、腹式呼吸、紫绀、蜷卧不动）、ELISA检测肺泡灌洗液中不同IL及对应水平，细胞Th1、Th2、Th1/Th2比例水平。结合中医证候，肾气虚哮喘模型中还应检测血清四碘甲状腺原氨酸、血清皮质醇、睾酮水平，反映机体哮喘发病和肾气虚情况[17]，脾气虚哮喘动物模型通过摘取脾脏、胸腺称取器官质量，测定脾淋巴细胞增殖功能作为检测指标[18];肺气虚哮喘模型可检测肺功能（呼气容积、吸气阻力、呼气阻力、肺顺应性）及氧饱和度作为评价指标。
　　2.3  热证模型
　　 热证多指热邪侵袭、阳气旺盛或阳盛阴虚所致机能活动亢进所表现的证候，“阳胜则热”，临床热证患者多见身热烦躁、面目红赤、唇红而干、咽燥口渴、喜冷饮、大便秘结、小便短赤且黄等症状。然“热极湿动”，尤其我国南方地区或长夏时间，“长夏湿令，暑必挟湿”。热邪夹杂湿邪，演变成湿热哮喘。热证模型的建立主要通过灌胃热性药物或食肥甘厚腻之物。
　　2.3.1  造模与给药
　　 方向明等[19]选择SD大鼠，采用OVA腹腔注射联合细菌脂多糖滴鼻复制热证哮喘模型。第1、8日腹腔注射OVA致敏液，双侧鼻孔鼻滴血清脂肪酶稀释液，第15日起置于雾化箱以OVA雾化诱喘，每次30 min，每日1次，连续7 d。卢立伟等[20-21]选择SD大鼠，采用多因素干预造模方法建立湿热证哮喘大鼠模型。每日上午和夜间予高脂饲料灌胃，2 mL/只，连续14 d。第7、14日予10%OVA氢氧化铝生理盐水混悬液腹腔注射致敏，1 mL/只。第12日进行大肠杆菌灌胃，每只2 mL，12 h后再加强灌服大肠杆菌，每只1 mL。第13日起将大鼠置于温度（33±2）℃、相对湿度（95±3）%的湿热环境，共3 d，每日8 h。第16日起将大鼠置于雾化箱，OVA生理盐水溶液雾化诱导哮喘，每日1次，每次30 min，连续7 d。
　　2.3.2  评价指标
　　 热哮证行为学反应有发热、烦躁、口渴等症状，研究表明，热哮证主要病机是中性粒细胞（PMN）局部募集浸润，病理学检查以白细胞计数、PMN检测为评价指标。湿热证可通过观察动物行为评价，如蜷卧、不思饮食、小便發黄、大便黏滞较软甚则出现溏泄，可见肛周污秽、红肿，肛温升高，现代研究表明湿热因素明显影响Th1/Th2、Treg/Th17、IL-6等细胞因子，在多种炎性疾病中起重要作用[22]。
　　2.4  寒证模型
　　 寒有内寒和外寒之分，外寒主要是阴邪（多为寒邪）侵袭机体发生的病变，内寒主要由于机体阳气不足，阴阳失衡使阴寒偏盛，阳气相对衰弱，机能减退，又使外寒有机可乘，侵入肌表，寒证患者多有恶寒发热、四肢不温、喜热饮、腹泻等症状。实验研究中采用服用寒凉药物[23]、外界环境刺激复制寒证模型，但服用寒凉药物针对的是脾胃寒证模型的建立，哮喘的产生主要由肺的宣降失常所致，检测指标的部位主要选择肺，故一般哮喘模型中不常用[24]。
　　2.4.1  造模与给药
　　 余建玮等[25]采用OVA致敏并冷风诱发哮喘复制寒证哮喘模型。第1、8日腹腔内注射抗原液1 mL，2周后激发哮喘，大鼠置于自制半密闭鼠笼，雾化吸入1%OVA生理盐水40 min，每日1次，连续4 d。中医模型Ⅰ组在致敏后第4日予冷风（气温为0 ℃±4 ℃）吹袭连续14 d，中医模型Ⅱ组诱喘后予腹腔注射地塞米松以平喘，平喘后第7日开始予冷风吹袭诱喘，连续10 d，中医模型Ⅲ组诱喘后予腹腔注射地塞米松以平喘，平喘后第14日开始予冷风吹袭诱喘，连续10 d。张庆祥等[26]选择Wister大鼠，采用OVA致敏结合形寒饮冷与劳倦刺激相结合的方法复制大鼠哮喘病寒饮蕴肺证病证结合模型。腹腔注射抗原液1 mL使大鼠致敏，2周后将其置于雾化器雾化吸入5%OVA生理盐水40 min诱发哮喘，每日1次，连续8 d。造模期间，予饮冰水、食寒性食物，并每日让大鼠在（0±2）℃冰水中游泳30 min。激发期间，将大鼠置于（0±4）℃室外环境（12 h/d），进行“饮冷”“形寒”“劳倦”的外部刺激。 　　2.4.2  评价指标
　　 外部环境刺激下的哮喘寒证模型评价主要通过行为学观察，因机体外感于寒，内伤于阳，造成肺阳虚衰，宣降失常，寒饮内停于肺，在哮喘大鼠腹式呼吸、紫绀、抓耳挠腮的基础上还伴随喉鸣、咳嗽、憋喘、喜热饮、四肢不暖、蜷卧懒动，严重者出现唇鼻青紫的情况，指标监测中观察肺泡灌洗液中有白色泡沫痰，白细胞计数增多，嗜酸性粒细胞百分比升高[26]。
　　3  小结
　　 综上，OVA是目前哮喘模型中使用最广泛的致敏原，分为致敏和激发两个主要步骤，基本方法是腹腔或皮下注射OVA致敏后进行OVA生理盐水溶液雾化激发，造模时间根据造模的类型及程度2～4周不等。
　　 过敏性哮喘模型选择动物以大鼠居多，其次是小鼠、豚鼠，均采用相同哮喘评价指标。行为学方面，体质量增长缓慢且毛发粗糙无光，雾化激发时出现呼吸急促、张口喘息、腹式呼吸、紫绀及行动迟缓等症状，并随着雾化次数的增加情况逐渐加重;药理学方面，对于脏器的观察一般选择肺脏，哮喘是由急性发生转向慢性反复发作，气道一直处于损伤再修补的过程，存在大量的炎性细胞，炎症介质浸润并继发气道重塑[27-28]，肺组织HE染色可见支气管周围有大量炎性细胞浸润、炎性细胞和渗出物增多等[29]，血中嗜酸性粒细胞数量增多[30]、血总IgE对哮喘的发作起重要作用[31]，外周血嗜酸粒细胞直接计数与分类值增高，血清总IgE水平也显著升高[32]。
　　 笔者认为，中医动物模型建立仍存在一些问题：①中医实验是在中医药理论指导下辨证论治，而疾病不同时期的证表现出的症状不尽相同，过敏性哮喘为慢性病，病程较长，发病初期、中期、末期症状不同，但造模过程的给药和给药量在病情发生期前后一致，无法做到同病异治;②中医“藏象学说”可反映各脏腑生理功能、病理变化及其相互关系：脏与脏间的生克乘侮，六腑以传化物为生理特点，脏与腑的阴阳表里关系，一脏发生病理变化则牵一发而动全身，过敏性哮喘的病脏不仅在肺，脾胃、肾、肝、大肠均会累及，指标检测不能仅关注单一脏腑;③疾病发生或因单因素初起，随疾病的发展，单因素会转变成体内外的多因素，但目前造模方式仍然以单因素为主;④中医四诊合参感知疾病的发展，但用于动物模型只能做到观形态、看神色、听声音、嗅气味，无法做到四诊与指标相结合;⑤实验常用的啮齿目、灵长目、食肉目等与人类均有差异，动物模型无法完全按照人类哮喘的发作机理进行研究，微观指标监测也因为差异性而出现结果偏差。综上，过敏性哮喘的中医证候模型研究尚处于起步阶段，其致病因素、病因病机与发病转归等与临床实际仍存在差异，需进一步探索。
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　　（收稿日期：2018-08-07）
　　（修回日期：2019-06-04;编辑：向宇雁）
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