景虎通脉方对急性脑缺血大鼠模型的脑保护作用研究

来源:用户上传      作者:刘晓敏　解欢琼　陶相宜　袁滔　苏玉杰

　　摘要：目的 探討景虎通脉方对急性脑缺血的治疗作用及机制。方法 健康成年雄性Wistar大鼠80只，随机分为假手术对照组、模型对照组、尼莫地平组、景虎通脉方高剂量组、景虎通脉方中剂量组、景虎通脉方低剂量组。每组10只。除去假手术对照组，余各组大鼠采用线栓法制作急性脑缺血动物模型。造模前预防给药7次，造模后给药3次，每天1次。检测大鼠脑组织匀浆中MDA、NOS的含量及SOD的活力。结果 与模型组相比，景虎通脉方高、中、低剂量组脑组织匀浆中SOD水平分别为（544.76±40.19）U·mL-1、（537.76±38.80）U·mL-1、（524.43±61.18）U·mL-1，景虎通脉方高、中剂量组脑组织匀浆中NOS水平为（37.83±4.36）U·mL-1、（36.94±2.18）U·mL-1，景虎通脉方中剂量组脑组织匀浆中MDA水平为（3.36±1.55）U·mL-1，结果具有统计学意义。结论 景虎通脉方对大鼠急性脑缺血有一定的治疗作用，其机制可能与抗氧自由基及抗氧化途径有关。
　　关键词：景虎通脉方;急性脑缺血; MDA; NOS; SOD
　　中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）03-0065-04
　　Study on the Protective Effect of Jinghu Tongmai Recipeon Acute Cerebral Ischemia Rat Model
　　LIU Xiao-min1， XIE Huan-qiong1， TAO Xiang-yi1， YUAN Tao2， SU Yu-jie2
　　（1. Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica， Kunming 650500， China）
　　【Abstract】Objective： To explore the therapeutic effect and mechanism of Jinghu Tongmai Recipe on acute cerebral ischemia. Methods： 80 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into a sham operation control group， a model control group， a nimodipine group， and Jinghu Tongmai Recipe groups with high， medium and low dose， 10 rats per group. Except the rats in the sham operation control group， the rats in the other groups were made into animal models of acute cerebral ischemia by suture method. Preventive administration was given 7 times before modeling and 3 times after modeling， once a day. The contents of MDA and NOS and the activity of SOD in rat brain tissue homogenate were detected. Results： Compared with that of the model group， the levels of SOD in brain tissue homogenates of Jinghu Tongmai Recipe groups with high， medium and low dose were （544.76±40.19）U·mL-1， （537.76±38.80）U·mL-1 and （524.43±61.18）U·mL-1， respectively. The NOS levels in brain tissue homogenates of the high and medium dose groups were （37.83±4.36）U·mL-1and （36.94±2.18）U·mL-1， The MDA level in the brain tissue homogenate of the medium dose group was （3.36±1.55）U·mL-1. The results were statistically significant. Conclusion： Jinghu Tongmai Recipe has a certain therapeutic effect on acute cerebral ischemia in rats， and its mechanism may be related to antioxidant free radicals and antioxidant pathways. 　　【Key words】Jinghu Tongmai Recipe， acute cerebral ischemia， MDA， NOS， SOD
　　急性腦缺血病属中医学“中风”的范畴，具有高致病率、高致残率、高致死率的特点[1]，景虎通脉方是第3～5批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师赵淳教授用于治疗急性缺血性脑血管疾病的经验方，在临床上运用多年，取得了良好的疗效。本研究在成功复制急性脑缺血大鼠模型基础上，观察景虎通脉方对大鼠脑组织总超氧化物岐化酶（SOD）、一氧化氮合成酶（NOS）、丙二醛（MDA）的影响，以期探讨其作用机制。现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验药物及分组 Wistar大鼠80只，雄性，体质量200～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司。动物生产许可证号：SYXK（滇）K2013-007。大鼠饲养于SPF级动物实验室，温度20～25℃（日温差≤3℃）;湿度40%～70%;照明12 h：12 h明暗交替，照度150～300 lx;噪音≤60 dB。随机分为六组：假手术组、模型组、尼莫地平组、景虎通脉方高剂量组（以下称高剂量组）、景虎通脉方中剂量组（以下称中剂量组）、景虎通脉方低剂量组（以下称低剂量组）。
　　1.2 药物与制备方法 景虎通脉方：红景天10 g（购自云南福林堂药业有限公司），虎杖15 g，三七15 g，茯苓15 g，白首乌15 g（购自云南省中医医院中药房）。菲牛蛭冻干粉0.6 g（云南海瑞迪生物公司，批号C05-14111101，温水兑入）制备方法：经水煎，制备流浸膏，按大鼠给药剂量10 mg/kg算，称取浸膏4.68 g，充分研磨后配置10 mL设置为中剂量，高剂量为此剂量的2倍，低剂量为此剂量的1/2。尼莫地平片[国药准字H14022821]，每片20 mg，由亚宝药业集团股份有限公司生产，批号1705546。用时将药片碾碎加入蒸馏水制成 20%混悬液，即 100 mL蒸馏水中加入1片尼莫地平片。
　　1.3 试剂与仪器 总超氧化物岐化酶（SOD）测定试剂盒（批号A001-1），一氧化氮合成酶（NOS）（A014-2），丙二醛（MDA）测试盒（A003-1）、NOS检测试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。RF-5000型荧光分光光度计（日本岛津）提供，恒温水浴箱型号DK-S24 上海森信提供 台式离心机 型号H1750R由湘仪公司提供。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1 急性脑缺血动物模型制备 按文献方法造大鼠大脑中动脉缺血模型[2]用大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（35mg/100 g体重），仰卧于手术台上，沿颈正中切开，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA、，颈内动脉（ICA）、沿ICA向下分离翼颚动脉，在ECA远心端、近心端分别穿线，远心端系紧，近心端打一松结（备线），用微血管夹暂时夹闭CCA、ICA和翼颚动脉。在ECA的两线间剪一小口，将制备好的一端加热成球型的1.5号尼龙栓线（直径0.20 mm）经小口插入ECA，将ECA近心端的备线系紧，移去ICA处的血管夹，栓线经CCA分叉进入ICA并继续入颅至大脑前动脉ACA近端，此时可感觉到轻微阻力，根据大鼠体重，尼龙线插入深度为1.9～2.3 cm移去，CCA翼颚动脉处血管夹，皮肤缝合，即制成右侧大脑中动脉局灶性脑缺血（MCAO）模型假手术组同样进行麻醉，皮肤切开，血管分离后，不夹闭血管及插入栓线直接缝合皮肤。
　　1.4.2 大鼠MCAO模型鉴定及 动物清醒后按照 Longa的 5分法评分。0分：无神经缺损症状。1分：左前肢不能完全伸直。2分：向左旋转。3分：向左侧倾倒。4分：不能自己行走或昏迷。1～4分为有效模型。
　　1.5 检测指标 检测方法：造模给药完成后，处死大鼠，取大脑组织，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，称取适量组织，加入9倍预冷PBS（磷酸缓冲液），超声破碎仪冰浴处理组织后，5000 rpm/min，离心20 min，取上清待测;按照南京建成生物工程研究所生产的检测试剂盒说明书方法检测，预实验摸索合适取样量及合适浓度匀浆样本检测;根据预实验结果选取0.25%浓度5ul样本检测;按公式计算总SOD活力=（对照孔OD值-测定孔OD值）/对照孔OD值/50%*166（根据本实验确定并计算出）/待测样本蛋白浓度，相同步骤用比色法根据吸光度的大小可计算出NOS活力，采用TBA法测定MDA活性。
　　1.6 统计方法 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，对计量资料进行t检验和方差分析，计数资料进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 景虎通脉方对急性脑缺血模型大鼠脑组织匀浆SOD水平的影响 模型组大鼠脑组织匀浆SOD水平较正常对照组降低，差别有统计学意义（P<0.05）。与模型组对比，尼莫地平组及景虎通脉方高、中、低剂量组脑组织匀浆SOD水平升高，差别有统计学意义（P<0.05）。与尼莫地平组对比，景虎通脉方中剂量组SOD水平较尼莫地平组升高，差别有统计学意义（P<0.01），见表1。 　　2.2 景虎通脉方对急性脑缺血模型大鼠脑组织匀浆NOS水平的影响 模型组大鼠脑组织匀浆中NOS含量低于假手术组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），与模型组对比，尼莫地平组、景虎通脉方高、中剂量大鼠组脑组织匀浆NOS活性均高于于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.3 景虎通脉方对急性脑缺血模型大鼠脑组织匀浆MDA水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织匀浆MDA显著增高（P<0.01），与模型对照组对比，景虎通脉方中剂量组大鼠组脑组织匀浆MDA含量低于模型组，差别有统计学意义（P<0.05）
　　3 讨论
　　赵淳教授认为，急性缺血性脑血管病属于中医“中风病”范畴，本病多由过食肥甘、脾虚失运，水谷精微不归正化，生成脂浊痰湿。水谷精微由清化浊，变生痰浊，留滞血脉之中，凝聚成块[3]，如《医学正传》云：“津液稠黏，为痰为饮，积久渗入脉中，血为之浊。”痰借血体，血借痰凝，痰瘀互结，凝于血脉，日久胶结不解，如《血证论》中云：“血积既久，亦能化为痰水。”最终成瘀，闭阻脑络，“毒邪”内生而发病。本病病机为血瘀脑络、升降逆乱、腑气不通，治疗应通腑泄浊，使络通瘀化、调畅气机为法。
　　急性脑缺血疾病发病过程中，脑缺血的损伤机制较复杂。目前已知的缺血性脑损害的机制主要有钙超载及兴奋性氮基酸的神经毒性、自由基与再灌注损伤、以及脂类介质的毒性作用，缺血性脑水肿等方面[4]，在急性脑缺血的发展过重中，自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生过氧化脂质与丙二醛（MDA），致使各种生物膜结构与功能出现交替损伤，血管内皮细胞损伤，血管通透性增强，致使血管源性脑水肿加重，同时脑缺血后，一氧化氮（NO）的含量明显升高，过量产生的NO可以与超氧自由基作用形成过氧亚硝酸盐或者氧化产生亚硝酸阴离子，它们都有细胞毒性作用，可加重缺血损伤。一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮的酶。前神经保护机制主要包括抗氧化、调节NO合成、保护线粒体功能、抑制神经细胞凋亡、抗炎、抑制兴奋性神经毒性、抑制钙离子超载等方面[5]。
　　景虎通脉方中君药红景天味甘、涩，归肺经，功能补气清肺，益智养心，收涩止血，散瘀消肿。虎杖清热解毒、活血散瘀、祛湿泻浊，菲牛蛭具有破血通经，逐瘀消癥之功，《神农本草经》：“主逐恶血，瘀血，月闭，破血逐瘀，无子，利水道。”三七散瘀止血，消肿定痛，《本草纲目》云：“三七止血，散血，定痛。”《玉揪药解》云：“三七和营止血，通脉行瘀，行瘀血而敛新血。”三药共为臣药。茯苓健脾利湿化痰。白首乌补肝肾，益精血，止心痛。全方共奏活血化瘀、益气通脉、解毒豁痰之效，其通補兼施，标本兼顾，痰、瘀、毒、虚同治。
　　方中红景天其药理成份红景天苷，可改善急性脑梗死患者脂质过氧化作用，促进氧化自由基分解，降低体内炎性反应[6]，其药理成分黄酮类物质[7～8]能多方面改善细胞组织与脏器的代谢和功能，通过抑制细胞内钙超载，减少神经细胞的凋亡，能促进神经干细胞向神经元方向分化，起到保护神经细胞作用，对脑梗塞后遗症的治疗有着很大的作用。刘建明[9]研究认为红景天苷对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有显著的保护作用。虎杖的药理成分[10]能改善胶原酶Ⅶ诱导的脑出血大鼠的神经功能缺损、减轻脑水肿，提高脑出血大鼠脑组织中超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛水平。保护海马区提示虎杖昔可过通钙拈抗作用，三七主要成分为三七总皂苷，有研究[11]认为三七有效成分抑制了中性粒细胞的黏附、聚集，降低了中性粒细胞的趋化运动，减弱了中性粒细胞在缺血脑组织的浸润和活化，减轻了脑组织的损害，在急性脑缺血过程中，可提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的抗氧化活性。减轻大脑局灶性缺血性损伤的程度，可显著抑制由缺血再灌注诱导的脑神经细胞凋亡，从而起到一定程度的神经保护作用[12～13]。菲牛蛭俗称金边蚂蟥，其抗凝血作用、抗血栓作用优于其他水蛭，可抑制动脉粥样硬化斑块形成，增加斑块内胶原，增加动脉粥样硬化斑块的稳定性[14～15]。白首乌可通过抗氧化作用减轻脑缺血再灌注损伤，并显著提高小鼠的耐缺氧能力。且明显的降低脑匀浆中MDA和NO的含量，提高SOD的活性。
　　本研究结果显示，景虎通脉方可调节急性脑缺血大鼠脑匀浆中MDA和NOS含量，提高急性脑缺血大鼠脑匀浆中SOD活性，可认为景虎通脉方可通过抗氧自由基及抗氧化途径，对急性脑缺血疾病起到治疗作用。中医药治疗在治疗急性脑缺血疾病治疗过程中具有多成分、多靶点、多环节的特性，这一途径可能只是景虎通脉方治疗急性脑缺血作用机制的一部分，是否还存在其他的作用环节和保护机制值得进一步深入研究。
　　参考文献：
　　[1]冯蕾，陈瑶，王健.急性脑梗死患者中医证型与PCT CRP IL-6 TNF-α相关性分析[J].云南中医中药杂志，2019，40（7）：13-15.
　　[2]张小冲，赵浩，马建华，等.线栓法大鼠MCAO模型的实验研究[J].医学研究杂志，2013，06：55-58.
　　[3]赵淳，叶勇.病症结合救治急危重症：赵淳学术思想与临床经验集[M].北京：中国中医药出版社，2015：52-53.
　　[4]王瑜.中药治疗脑缺血及对脑保护作用的研究[J].中医药学刊，2002，20（3）：371-372.
　　[5]李娟，魏亚洲，范正公.中草药神经保护作用机制的研究现状[J].中国临床康复，2005，9（41）：108-110.
　　[6]陈玉满.高山红景天的耐缺氧作用实验研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17（8）：1494～1510.
　　[7]李青，陈悦，高万峰，等.红景天苷对急性脑梗死尿激酶静脉溶栓患者早期再灌注的保护作用分析[J].中国基层医药，2017，24（13）：1969-1973.
　　[8]陈玉满，陈江，毛光明，等.高山红景天的耐缺氧作用实验研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17（8）：1494-1495，1510.
　　[9]刘建明，邱光明，王芳，等.红景天苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].基层医学论坛，2011，34：1106-1107.
　　[10]邓学军，孙圣刚，梅元武，等.白藜芦醇甙保护脑海马区缺血神经元的机制探讨[J].现代康复，2001，5（13）：52-53.
　　[11]任周新，孙建宁，赵辉，等.三七总皂苷对MCAO大鼠脑组织中性粒细胞浸润及相关炎性因子的抑制作用[J].中成药，2009，31（9）：1345-1347.
　　[12]肖丽娜，肖凌峰.血塞通对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].福建中医学院学报，2008，18（4）：21-23.
　　[13]蒋祁桂，刘赛林.血塞通对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡影响的研究[J].山西中医，2007，23（1）：68-69.
　　[14]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，2006：709.
　　[15]黄栎莹.菲牛蛭对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响[D].广西医科大学，2016.
　　[16]陈美华，吴娟娟，朱玉云，等.白首乌对实验性小鼠抗氧化及耐缺氧作用的研究[J].中国食物与营养，2010（1）：71-73.
　　（收稿日期：2019-10-21）
转载注明来源:https://www.xzbu.com/6/view-15192721.htm