交联透明质酸钠微生物限度检查方法验证

来源:用户上传      作者:徐雯 曹弋 吴剑英

　　摘 要 目的：建立合适的交联透明质酸钠微生物限度检查方法及控制菌检查方法，并进行方法学验证研究。方法：在前期摸索的提高稀释倍数方法的基础上，依据《中国药典》2015版采用滤纸过滤加薄膜过滤法对交联透明质酸钠进行微生物限度检测。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查试验中5种测试菌的回收率均在0.5～2.0之间，符合规定。结论：该检查方法操作方便，结果准确可靠，适用于交联透明质酸钠的微生物限度检测。
　　关键词 交联透明质酸钠 微生物限度 薄膜过滤法
　　中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）13-0070-03
　　Validation of microbial limit test method for cross-linked sodium hyaluronate
　　XU Wen1*， CAO Yi1， WU Jianying2**
　　（1. Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200231， China； 2. Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）
　　ABSTRACT Objective： To establish a microbial limit detection method for cross-linked sodium hyaluronate and verify the methodology to ensure its applicability. Methods： According to the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia， the total number of aerobic bacteria， molds and yeasts in cross-linked sodium hyaluronate was tested by membrane filtration method. Results： The recovery rates of the five test microoganims were in the range of 0.5 to 2.0， which were in compliance with the regulations. Conclusion： The method is accurate， reliable， easy to be operated and suitable for the detection of microbial limit of cross-linked sodium hyaluronate.
　　KEy WORDS cross-linked sodium hyaluronate； microbial limit； membrane filtration method
　　透明质酸是一种多功能基质，广泛分布于人体各部位。其凝胶制剂广泛应用于眼科黏弹性保护剂、骨科功能改善剂、外科防粘连保护剂、组织填充剂（如整形外科）等领域，在临床已应用十多年，其安全性及有效性得到了医学各界普遍认可[1-2]。天然透明质酸钠用于关节腔注射治疗骨关节炎（OA）患者时，其在体内半衰期仅为1～2 d，关节腔存留时间过短限制了其作用的发挥。利用其分子中的羟基、羧基、Ⅳ-乙酰氨基和还原末端与不同的交联剂反应可得到不同类型的交联透明质酸钠凝胶产品，不仅可以保留原有的生物相容性、细胞黏附能力，而且具有更好的流变性能，机械强度和较高稳定性，延长其在体内的存留时间[3]。
　　在交联透明质酸钠凝胶产品的开发过程中，通过透明质酸钠干粉和交联剂进行交联反应后制备得到交联透明质酸钠凝胶中间品，在成为最终产品前应对中间品的微生物污染状况进行控制。但是由于交联透明质酸钠凝胶中间品为较透明质酸钠自身更高黏度的颗粒凝胶，而且产品使用交联剂进行反应后其组成成分较复杂，因此交联后的透明质酸钠的微生物限度的检测方法应与其原料检测方法有所不同，其微生物限度的检测具有一定的难度[4-5]。笔者在前期研究中，通过采用提高稀释倍数加薄膜过滤法，初步摸索了产品的稀释倍数，但是试验结果中交联剂辅料和菌落混淆，影响平板观察，因此本研究进一步改进试验方法，采用一定的稀释倍数，并通过定性滤纸过滤加薄膜过滤法，验证该方法适用于交联透明质酸钠微生物限度的檢测。
　　1 材料和方法
　　1.1 菌株与培养基
　　金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母、黑曲霉和大肠埃希菌6种菌株均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为：191024、190822、191112、191031、191010、191022。
　　胰酪大豆胨琼脂TSA、沙氏葡萄糖琼脂SDA、胰酪大豆胨液体TSB，批号分别为20180123、20180102、20190226，均来自北京三药科技开发有限公司并经过适用性检查，符合要求。
　　1.2 试样与试剂
　　交联透明质酸钠凝胶中间品（批号1912271，上海建华精细生物制品有限公司自制），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称为缓冲液）按照中国药典2015版四部通则配制[6]。
　　1.3 仪器
　　SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；YXQ-SG46-280S型灭菌锅（浙江新丰医疗器械有限公司）；PL2002型天平（Mettler Toledo）。一次性微孔滤膜（孔径：0.45 mm；批号：191028；上海兴亚净化材料厂）。 　　1.4 方法
　　参照中国药典2015版四部通则1105和1106[6]进行试验。
　　1.4.1 供试品和菌液的制备
　　取交联透明质酸钠凝胶中间品1 g加入缓冲液100 ml，产品黏度高，应充分振摇至完全溶解，再经已灭菌的定性滤纸过滤后收集溶液即为供试品。6种定量菌株均按说明书加入复溶溶液1.0 ml后完全溶解即为测试菌。
　　1.4.2 需氧菌总数计数方法的验证
　　取一批供试品用需氧菌进行测试，重复操作3次。①测试组：取100 ml供试品和0.1 ml的测试菌菌悬液（不超过100 cfu）混合，用薄膜过滤法进行测试。冲洗溶液为300 ml缓冲液，每次用100 ml冲洗3次，将滤膜粘贴在装有TSA培养基的平皿中，置于30～35 ℃倒置培养。②菌液对照组：取100 ml缓冲液加入测试菌，进行回收率试验。③供试品对照组：不加入测试菌，测定供试品微生物数量。
　　1.4.3 真菌总数计数方法的验证
　　以白色假丝酵母和黑曲霉为测试菌按1.4.2同法操作，置于装有SDA培养基的平皿中，置于20～25 ℃倒置培养。
　　1.4.4 计算公式及可接受标准
　　测试组菌数回收率=（测试组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数，均在0.5～2.0的范围内。
　　1.4.5 控制菌检查法的验证
　　以大肠埃希菌为测试菌按1.4.2同法操作，置于TSB中进行培养。
　　2 结果
　　2.1 需氧菌总数计数方法的验证
　　交联透明质酸钠凝胶供试品进行平行3次验证试验结果见表1，供试品对照组中3种测试菌株菌落数均为0，试验中3种测试菌回收率均在0.90～1.10之间，符合可接受标准，表明方法适用。
　　2.2 真菌总数计数方法的验证
　　采用一批供试品进行平行三次验证试验结果见表2，供试品对照组中2种测试菌株菌落数均为0，试验中2种测试菌回收率均在0.90～1.10之间，符合可接受标准，表明方法适用。
　　2.3 控制菌检查法的验证
　　采用一批供试品进行平行三次验证试验结果见表3，结果表明适用性试验符合要求。
　　3 讨论
　　交联透明质酸钠凝胶产品为一种无色透明的凝胶溶液，其黏度高达200 Pa·s以上，在微生物限度检测中需消除其高黏度对检测的影响，而本产品中含有交联剂辅料也会影响微生物限度的检测。本次研究前期通过查阅相关参考文献[7-10]，摒弃了透明质酸微生物限度检查中采用酶降解后进行加热溶胀的预处理方式，将交联透明质酸钠供试品进行一定的稀释，消除了产品高黏度对检测的影响，操作简便。前期研究中选择pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液，稀释倍数为100倍，可保证溶液混合均匀，使得在采用薄膜过滤法的过程中产品的过滤速度较快，消除产品的高黏度对检测的影响，但是仅对产品进行稀释的试验结果发现供试品对照组及测试组培养皿生长的菌落混浊，导致无法对菌落进行计数。因此在本研究中研究者继续摸索了去除辅料干扰的预处理方式，在前期研究确定稀释倍数的基础上再通过定性滤纸过滤的方法处理交联透明质酸钠凝胶，并采用薄膜过滤法消除产品中交联剂辅料的干扰。
　　本研究表明，采用上述预处理方式进行交联透明质酸钠微生物限度检查符合中国药典检测微生物限度的有关要求。也许还有更适合的稀释浓度可以消除产品高黏度对检测的干扰，研究人员将继续摸索以期发现更合适的稀释倍数。
　　参考文献
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