台湾牛樟总DNA提取方法研究及其PCR验证

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　　摘  要：采用Biospin（Cat#BSC13S1、Cat#BSC13S1B）和“TIANGEN”（Cat#DP305-03）植物基因组DNA提取试剂盒，对台湾牛樟总DNA的提取方法进行了研究。结果表明：Cat#BSC13S1普通试剂盒比专门提取多糖多酚植物DNA的Cat#BSC13S1B试剂盒的效果更好，且博日Cat#BSC13S1试剂盒的DNA提取效果优于天根Cat#DP305-03试剂盒。经PCR验证，试剂盒法提取的牛樟叶总DNA可满足后续分子生物学实验的要求。
　　关键词：牛樟;DNA提取;改良试剂盒法
　　中图分类号 Q946.2 文献标识码 A 文章編号 1007-7731（2019）（02-03）-0007-03
　　Abstract：In this experiment，the modified kit was used to extract total DNA which are The Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit （Cat#BSC13S1&Cat#BSC13S1B）and the "TIANGEN" Plant Genomic DNA Extraction Kit （Cat#DP305-03）.Experimental results show that，the result of DNA extracting by Cat#BSC13S1 is better than Cat#BSC13S1B and Cat#DP305-03.PCR amplification indicated that the total DNA could be used for subsequent molecular biology studies.
　　Key words：Cinnamomum kanehirae Hay;Extraction of total DNA;the modified kit
　　1 前言
　　台湾牛樟（Cinnamomum kanehirae Hay）为台湾特有的优质用材树种，是一种发展潜力巨大的树种，其树形壮实高大，是优良的景观树种;其木材是家具、木雕的优质原材料;其含有的黄樟油素是重要的工业原料;其木段寄生真菌牛樟芝在治疗癌症等方面具有极高的药用价值，被称为“森林中的红宝石”[1-4]。除了野生资源，也可利用牛樟椴木进行牛樟芝的人工培养，牛樟椴木培养的牛樟芝，其有效活性物质远远优于其他椴木培养的牛樟芝[5]。因此，近年来中国大陆各地都进行了引种研究。
　　近年来，随着人们生活品质的提高和保健意识的增强，高品质牛樟芝的市场需求量越来越大，但与此同时，其专一寄主牛樟的品质及身份也需要保证[5]。目前，仅通过形态分类难以鉴别牛樟的身份，牛樟的分子鉴定技术亟待建立。从分子水平上对牛樟的基因资源及遗传基础进行研究，是牛樟研究的一个重要侧面，而获取高质量的总DNA是开展分子生物学研究的基础。Huang等[6]从牛樟等3种樟属植物中分离出15个微卫星序列，认为这些微卫星序列在3种植物中有特定的拷贝数，可用于辅助物种鉴定。由于樟科植物含有大量的多糖及次生代谢物质，给DNA的提取带来了一定的难度。为此，笔者就牛樟DNA提取技术进行了探索，旨在寻找一种获取牛樟总DNA较佳的途径，为牛樟的分子生物学研究提供理论依据。
　　2 材料与方法
　　2.1 材料 牛樟叶于2017年5月和11月份采自福建省龙海市九龙岭林场的1年生植株，该牛樟系从台湾工业技术研究院南分院引种。随机选取若干片嫩叶，放置于塑料自封袋中，并用变色硅胶进行迅速干燥，然后将干燥的材料速带回实验室，于-80℃超低温冰箱保存备用。
　　2.2 总DNA提取方法 采用2种方法进行DNA提取，分别为杭州博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒法（以下简称“博日试剂盒法”）和“TIANGEN”植物基因组DNA提取试剂盒法（以下简称“天根试剂盒法”）。
　　2.2.1 Biospin植物基因组DNA提取试剂盒（Cat#BSC13S1）法 本实验并未完全按照说明书来操作，而是在其基础上略作改良。主要修改的地方有以下几点：（1）加450μLLP Buffer改成加500μl的LP Buffer。可选步骤中加入4μL的100mg/μL的RNaseA，改成加入40μL的10mg/μL的RNaseA。（2）于65℃环境中温浴15min，将15min改成30min。（3）加入150μLDA Buffer 改成加入200μLDA Buffer。（4）第10步与第11步的“于10000xg 离心30s”改为“于10000xg离心1min”。
　　2.2.2 “TIANGEN”植物基因组DNA提取试剂盒（Cat#DP305-03）法 对实验方法与药剂用量稍作调整后进行基因组DNA的提取，具体改动步骤：将“加入液氮充分碾磨;将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为1%）”改成“直接在研钵中加入1400μL65℃预热的缓冲液GP1（先预热再加巯基乙醇1.4μL，使其在GP1中终浓度为1%），迅速研磨，直至样本完全液态化（水状），用去尖的枪头抽打混匀”。将原本的12000r全都改成13000r，离心30s改成1min。2次加入漂洗液PW的量原本都是600μL，改成第1次加入700μL，第2次加入500μL。洗脱缓冲液TE在使用前先经65～70℃水浴。
　　2.3 DNA质量检测 提取的DNA以1×TAE为缓冲液，取3μL在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察拍照，分析其完整性。用紫外分光光度计检测DNA样品的纯度、浓度和完整性等。 　　2.4 RAPD反应 以上述提得的样品DNA为模板，用已经筛选过的含10个碱基对的引物（表1），在Mastercycler proPCR仪上进行RAPD扩增。扩增体系为：总体积20μL，内含20ng模板DNA，0.2μmol·L-1引物，10μL的PCRMagicMix3.0。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，37℃复性30s，72℃延伸90s，循环40次;72℃延伸8min后于4℃保存。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶于5V/cm电场中电泳60min后在凝胶成像分析仪上检测并拍照记录。随机引物、PCR MagicMix3.0及其他试剂购自福州锐柏生物技术有限公司。
　　3 结果与分析
　　3.1 基因组DNA的提取 通过2种试剂盒法，从牛樟叶片中提取到基因组DNA，效果良好，浓度一般，能够满足后续实验要求。2种试剂盒法相比较，博日试剂盒提取的效果优于天根试剂盒法，前者提取的DNA的条带更加清晰明亮，DNA浓度明显高于后者提取的结果。OD值检测结果表明：2种方法提取的总DNA的A260/A280的比值分别处于1.61～2.10，DNA得率在24～362ng/μL，说明DNA中所包含的杂质较少，有少量的RNA残留。许多研究学者[7-8]发现模板中的少量的RNA残留对RAPD扩增没有影响，因此可继续后续实验。博日试剂盒法完全避免了与有毒试剂（如酚、氯仿）的接触，更加安全便捷。天根试剂盒法虽然还有巯基乙醇和氯仿的参与，但是效率比常规的CTAB方法更加快捷、方便。由于牛樟叶子富含多糖多酚物质，给DNA提取造成了一定困难，用博日试剂盒提取比较困难的一步就是抽提上清液，因为其上清粘稠度比较高，经常会将中间物质及下层液体一起吸上，从而导致DNA的提取失败。因此，建议在使用博日试剂盒法吸取上清液的时候，采取先将混合物全部转移至Shredder spin column这个方法。
　　近些年试剂盒法发展迅速，具有毒害少、效率高、操作简单，提取质量高等优点，随着试剂盒得率的增加，通用性的提升和价格的降低，试剂盒的应用将越来越普遍。本文所用2种试剂盒是市场上比较常见的。博日试剂盒有2种货号，一种是Cat#BSC13S1，另一种是Cat#BSC13S1B，后者是多了一个试剂LP plus Buffer，这个试剂在说明书上说的是“若提取富含多糖多酚的植物組织，请使用LP plus Buffer”。但是，在实验过程中发现：使用LP Buffer的效果比LP plus Buffer的效果好，DNA的浓度会相对较高，OD值也比较好。
　　3.2 RAPD扩增结果 用随机选取1个符合要求的基因组DNA对共10个不同引物进行RAPD扩增的结果。每个引物对这个DNA都能扩增出清晰可辨的条带，说明提取的DNA适于RAPD扩增分析。本实验也发现，模板DNA中有少量的RNA残留对RAPD扩增结果几乎没有影响。
　　4 结论与讨论
　　一定数量及高质量的DNA样品是进行限制性酶切、分子杂交、遗传多态性分析、PCR扩增以及基因组学等分子生物学研究的基础。因此，快速有效的DNA提取是成功的第一步，在DNA提取试剂盒逐渐商品化的进程中，选择一款适用且性价比高的产品也是很重要的。
　　由于牛樟叶片含有大量多糖、蛋白质、叶绿素及多酚类等物质，且叶片越老、这些物质含量越高，这给牛樟DNA的提取带来了一定难度，所以在材料选择时尽量选择幼嫩的叶片。常规的CTAB方法经常会有微量氯仿、CTAB、异丙醇等物质的残留，往往会影响到RAPD扩增的结果[9]。因此，选择试剂盒法可以避免这些药剂的使用，使扩增更容易。本次实验结果表明：2种方法提取的DNA都可以用于后续实验，但是总体来说博日试剂盒法更加有效、便捷，并且完全避免了与有毒试剂的接触，更加安全。
　　参考文献
　　[1]官锦燕，谭嘉娜，罗剑飘，等.牛樟的组织培养和植株再生[J].南京林业大学学报（自然科学版），2016，40（4）：63-68.
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　　[3]彭真汾，王威，谢倩，等.牛樟资源保护现状及繁育研究进展[J].亚热带农业研究，2016，12（1）：68-72.
　　[4]李亚龙，唐军荣，杨宇明，等.牛樟组织培养技术研究[J].福建林学院学报，2017，8（8）：48-53.
　　[5]孟红岩，郭莺，林文珍，等.台湾牛樟总RNA提取方法的建立[J].亚热带植物科学，2016，45（1）：53-56.
　　[6]H Hung-K，H Lin-C，C Shih-H，等.Development，characterization and cross-species ampli?cation of new microsatellite primers from an endemic species Cinnamomum kanehirae（Lauraceae）in Taiwan[J].Conservation Genetics Resources，2014，6（4）：911-913.
　　[7]冯斌，张希踔，解明，等.榛子种质资源多样性的RAPD分析[D].大连：辽宁师范大学，2007.
　　[8]汪小全，邹喻苹，张大明，等.RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题[J].植物学报，1996，38（12）：954-962.
　　[9]刘春林，官春云，李木旬.植物RAPD标记的可靠性研究[J].生物技术通报，1999（2）：33-36.
　　（责编：张宏民）
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