金鱼草花色素的提取工艺及其稳定性研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要：以粉红色金鱼草花瓣为原料，采用溶剂萃取法提取金鱼草花色素。用1 g ∶ 50 mL的料液比，选取提取剂、提取时间、提取温度、pH值等为萃取因素进行单因素试验，用4因素3水平正交表[L9（34）]进行正交试验优化试验，确定最佳的萃取条件。采用最佳的萃取条件提取金鱼草花色素，分析金鱼草花色素的稳定性。结果表明，金鱼草花色素的最佳萃取条件：以20%乙醇为萃取剂，提取温度为40 ℃，提取时间为30 min，pH值为7。金鱼草花色素具有一定的耐光性;不耐强酸，可在中性或碱性环境中保存;容易被氧化，耐还原性差;K+增色效果明显，但K+、Al3+、Cu2+、Fe3+会改变色素的颜色;食品添加剂对金鱼草花色素没有明显的影响。
　　关键词：金鱼草;花色素;提取工艺;稳定性;正交试验
　　中图分类号：R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0235-05
　　金鱼草（Antirrhinum majus L.），别称龙头花、狮子草、龙口花、洋彩雀等，玄参科金鱼草属，多年生草本植物。全草均可入药，具有清凉虚热、解除毒素、活通血液、消除肿痛等功能[1-2]。由于其花期长，花色丰富艳丽，是园林绿化和切花常用的草本花卉，也是研究分子生物学和遗传学，特别是花器官形成、转座子等方面的重要模式植物。金鱼草花色素作为一种天然色素，在食品、日化用品、保健品和纺织品等应用领域极具开发前景。
　　目前，国内外对金鱼草的研究主要集中在基因克隆及表达分析[3-8]、组织培养[9-13]、花香[14-15]、生長调控[16-18]、切花生产[19-22]等方面，对金鱼草花色素的研究尚少。本研究对金鱼草花色素的提取工艺进行研究，并对其稳定性进行分析，以期建立高效的金鱼草花色素提取工艺，为金鱼草花色素的开发提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　2017年9月采购云南斗南花卉市场的粉红色金鱼草切花，于广东海洋大学兴农楼318室进行干燥处理。
　　所用试剂有无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、六水氯化镁、九水硝酸铝、一水硫酸锰、七水硫酸锌、二水氯化钙、五水硫酸铜、六水氯化铁、亚硫酸氢钠、过氧化氢、蔗糖、可溶性淀粉等，均为分析纯，购自天津市致远化学试剂有限公司;食盐，购自广东省盐业集团有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司产品;咖啡研磨机，浙江永康铂欧五金制品有限公司产品;AY120电子天平，日本岛津公司产品;7200可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品;电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司产品;离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司产品。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 原材料处理 将新鲜的金鱼草花瓣，去除花柄、花蕊，洗干净花瓣上的花粉、灰尘等杂质，放入烘箱烘干直至恒质量。再用咖啡研磨机将干燥好的花瓣研磨成粉末[23]，过60目筛，备用。
　　1.3.2 金鱼草花色素的光谱特征 称取0.20 g花瓣粉末于试管中，用蒸馏水定容至10 mL，振荡，室温下浸泡提取 30 min，过滤得滤液，即金鱼草花色素提取液。以蒸馏水为参比液，室温下用分光光度计在320～400 nm波长内测定其吸光度，确定最大吸收波长。
　　1.3.3 金鱼草花色素提取的单因素试验
　　1.3.3.1 提取剂的选择 称取0.20 g花瓣粉末于试管中，分别以蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇、10%丙酮、1% HCl、1%柠檬酸作为提取剂[24]，定容至10 mL，振荡，室温下浸泡提取30 min，过滤得滤液，用提取剂作为参比液，并用7200可见分光光度计在最大吸光波长处，测定不同上清液的吸光度（D），筛选出最佳的提取剂。
　　1.3.3.2 提取时间的选择 称取0.20 g花瓣粉末于试管中，用已选定的最佳提取剂，定容至10 mL，振荡，分别在室温下浸泡提取15、30、45、60、75、90 min，过滤得滤液，用提取剂作参比液，并用7200可见分光光度计在最大吸光波长处，测定不同上清液的D，筛选出最佳的提取时间。
　　1.3.3.3 提取温度的选择 称取0.20 g花瓣粉末于试管中，用已选定的最佳提取剂，定容至10 mL，振荡，分别在21（室温）、30、40、50、60、70 ℃浸泡提取，提取时间为“1.3.3.2节”中确定的最佳提取时间，过滤得滤液，用提取剂作参比液，并用7200可见分光光度计在最大吸光波长处，测定不同上清液的D，筛选出最适的提取温度。
　　1.3.3.4 提取剂pH值的选择 将上面得到的最佳提取剂用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaCl分别调节pH值至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。称取0.20 g花瓣粉末于试管中，分别加入已调好pH值的提取剂，定容至10 mL，振荡，在最适的提取温度下浸泡提取至最佳提取时间，过滤得滤液，用提取剂作参比液，并用7200可见分光光度计在最大吸光波长处，测定不同上清液的D，筛选出最佳的提取剂pH值。
　　1.3.4 金鱼草花色素提取的正交试验 考虑到各提取条件之间可能存在交互作用，会影响对金鱼草花色素的提取效果。综合上述试验结果，在单因素试验的基础上，设计一个4因素3水平L9（34）的正交试验，验证单因素试验的效果，确定金鱼草花色素的最佳提取条件。用提取剂作参比液，并用7200可见分光光度计在最大吸光波长处，测定不同上清液的D。正交试验设计如表1所示。
　　1.3.5 金鱼草花色素稳定性分析 用上述最佳提取条件提取金鱼草花色素溶液，备用。
　　金鱼草花色素的耐光性：取2份色素溶液，一份放置室内自然光下，一份放置黑暗条件下。在最大吸收波长处，每天测定其吸光度。 　　金鱼草花色素的耐酸碱性：取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量不同pH值（1～11）20%乙醇溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置2 h，在最大吸收波长处测定吸光度。
　　金鱼草花色素的耐还原性：取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L的NaHSO3溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置1 h，在最大吸收波长处测定吸光度。
　　金鱼草花色素的耐氧化性：取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量浓度为0%、5%、10%、15%、20%、25%的H2O2溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置1 h，在最大吸收波长處测定吸光度。
　　各种金属离子对金鱼草花色素稳定性的影响：取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量的蒸馏水及浓度为 0.1 mol/L含Na+、K+、Mg2+、Al3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+的溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置1 h，观察其颜色变化，在最大吸收波长处测定吸光度。
　　常见食品添加剂对金鱼草花色素稳定性的影响：取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量浓度为0、5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置 1 h，在最大吸收波长处测定吸光度;取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量浓度为0、2、4、6、8、10、12 g/L食盐溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置1 h，在最大吸收波长处测定吸光度;取色素溶液2 mL于试管中，分别加入等量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L可溶性淀粉溶液，振荡使其充分混合均匀，室温下放置1 h，在最大吸收波长处测定吸光度。
　　1.4 数据处理
　　每组试验重复3次，结果取平均值，采用Excel 2007软件对数据进行处理并作图，试验数据采用DPS统计软件中的LSD法对数据进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 金鱼草花色素的光谱特征
　　由图1可知，在波长为320～340 nm时，随着波长的增加，金鱼草花色素的吸光度上升，并在340 nm时达到最大值。而随着波长再增加，吸光度不断下降。由此判断，金鱼草花色素的最大吸收波长为340 nm。
　　2.2 金鱼草花色素的提取
　　2.2.1 单因素试验结果分析
　　2.2.1.1 最佳提取剂的选择 从图2可知，以10%乙醇、20%乙醇和10%丙酮为提取溶剂时，提取液的吸光度较大，其中20%乙醇提取液的吸光度最大;蒸馏水为提取溶剂时，提取液的吸光度次之;1%的 HCl和柠檬酸提取液的吸光度较小，提取效果较差。综合考虑，采用20%乙醇作为金鱼草花色素的提取剂。
　　2.2.1.2 最佳提取时间的选择 从图3可知，随着提取时间的延长，提取液的吸光度呈现先增大后减小的趋势，当提取时间为30 min时达到最大值，为0.753 9。当提取时间超过 45 min，提取溶液的吸光度逐渐降低，可能由于提取时间过长导致色素破坏。因此，选择30 min作为金鱼草花色素的最佳提取时间。
　　2.2.1.3 最佳提取温度的选择 从图4可知，随着提取温度的升高，金鱼草花提取液的吸光度随温度的升高而逐渐增大，并在40 ℃时达到峰值。当提取温度超过40 ℃时，金鱼草花提取液吸光度随温度的升高而减小。这说明随着提取温度的升高，可以加速金鱼草花色素溶解到提取液中，而温度超过40 ℃，可能会破坏色素的结构，色素发生分解。因此，选择 40 ℃ 作为金鱼草花色素的最佳提取温度。
　　2.2.1.4 最佳pH值的选择 从图5可知，在pH值为1～7
　　时，随着pH值的增大，金鱼草花色素的吸光度逐渐上升，并在pH值为7时达到峰值，为0.875 3，而随着pH值的进一步增大，吸光度下降。因此，选择pH值为7作为金鱼草花色素提取的最佳提取pH值。
　　2.2.2 正交试验分析结果 由表2可知，金鱼草花色素各提取条件的影响因素表现为乙醇浓度>提取温度>提取时间>pH值，最佳提取工艺组合为A3B1C3D3，即pH值为8，提取剂为20%乙醇，提取温度为50 ℃，提取时间为15 min。
　　2.3 金鱼草色素的稳定性分析
　　2.3.1 金鱼草花色素的耐光性 由图6可知，金鱼草花色素在光照环境下和黑暗条件下的吸光度变化趋势一致，说明金鱼草花色素具有一定的耐光性。2种环境下，金鱼草色素的吸光度从第1天到第3天不断下降，在第4天吸光度急速上升，第4天到第7天缓慢上升。可见随着时间的推移，金鱼草花色素稳定性降低，会产生其他物质。
　　2.3.2 金鱼草花色素的耐酸碱性 从图7可知，pH值在 1～3之间，金鱼草花色素的吸光度不断上升，pH值≥4时，金鱼草花色素的吸光度基本一致，没有明显波动。pH值为4～10这7个处理之间没有明显差异，pH值为3～11这9个处理的吸光度明显大于pH值为1、2时地吸光度。说明金鱼草花色素在 pH<3的强酸性环境下不稳定，在中性和碱性环境下能稳定保存。
　　2.3.3 金鱼草花色素的耐还原性 从图8可以看出，加入不同浓度NaHSO3的各处理的金鱼草花色素的吸光度均大于空白对照组。除0.20 mol/L NaHSO3处理外，不同浓度NaHSO3的各个处理与对照组之间都具有明显差异。加入NaHSO3后，所有金鱼草花色素的颜色均变成黄色。说明金鱼草花色素耐还原性差。
　　2.3.4 金鱼草花色素的耐氧化性 从图9可知，随着H2O2处理浓度的升高，金鱼草花色素的吸光度逐渐下降，说明金鱼
　　草花色素容易被H2O2氧化，金鱼草色素的耐氧化性不强。
　　2.3.5 各种金属离子对金鱼草花色素稳定性的影响 从图10可以看出，Na+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对金鱼草花色素吸光度基本无影响。而K+、Cu2+、Fe3+、Al3+对金鱼草花色素吸光度有明显影响，表明金鱼草花色素在Na+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+条件下稳定，在K+、Cu2+、Fe3+、Al3+条件下不稳定。加入K+后，溶液颜色由红棕色变成深棕色，加入Al3+后，溶液颜色由红棕色变成橙黄色，加入Cu2+后，溶液颜色由红棕色变成黄色，加入Fe3+后，溶液颜色由红棕色变成深褐色。因此金鱼草花色素加工和包装材料应避免接触铝、铜、铁。 　　2.3.6 常见食品添加剂对金鱼草花色素稳定性的影响 由图11可以看出，除加入30 g/L蔗糖后金鱼草花色素的吸光度与对照组有明显差异外，其他处理均与对照组之间没有明显差异;食盐、可溶性淀粉对金鱼草花色素的稳定性均无明显影响，可与金鱼草花色素混合使用。
　　3 讨论
　　天然色素与合成色素相比，具有较强的生理活性、来源广、对人体安全性高等特点。随着生活水平不断提高，人们的健康意识逐步增强，对天然色素产品的需求日益增加。天然色素被广泛应用于医药保健、食品添加剂、纺织品等应用领域[25-27]。金鱼草作为园林花卉在我国广为栽种，其花色丰富，可成为天然色素新来源。
　　国内外花色素的提取分离多采用有溶剂萃取法、超声波法、多级溶剂萃取法、吸附层析法[28-30]等。本研究将花瓣烘干后磨成粉末，采用溶剂萃取法，确定金鱼草花色素最佳提取条件：以20%乙醇为提取剂，提取温度为40 ℃，提取时间为 30 min，提取pH值为7。稳定性试验结果表明，金鱼草花色
　　素具有一定的耐光性;不耐强酸，可在中性或碱性环境中保存;容易被氧化，耐还原性差;Na+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对金鱼草花色素稳定性没有明显影响，K+增色效果明显，K+、Al3+、Cu2+、Fe3+会与金鱼草花色素发生颜色反应;食品添加剂蔗糖、食盐、可溶性淀粉对金鱼草花色素稳定性影响不明显。作为天然花色素，金鱼草花色素具有较大的应用前景，在食品、日化用品、纺织品和医疗保健品等中使用前，须要做进一步研究分析其毒性作用。
　　参考文献：
　　[1]李竹英，钱艳红，毛绍春. 不同激素对金鱼草茎尖组织培养效果初探[J]. 北方园艺，2006（3）：130-131.
　　[2]张喜艳，郑思乡. 不同倍性金鱼草形态学与染色体观察[J]. 云南农业大学学报，2009，24（2）：316-318.
　　[3]付宇辰，刘晓慧，冷平生，等. 金鱼草12-氧-植物二烯酸还原酶基因AmOPR的克隆及表达分析[J]. 中国观赏园艺研究进展，2018，2018：504-510.
　　[4]王少杰，刘晓慧，胡增辉，等. 金鱼草脂氧合酶基因AmLOX1的克隆及表达分析[J]. 中国细胞生物学学报，2018，40（6）：905-912.
　　[5]曹舸洋. 调节金鱼草叶序发育AmPIN1a基因克隆和转基因分析[D]. 合肥：安徽农业大学，2018.
　　[6]Naing A H，Park K I，Ai T N，et al.Overexpression of snapdragon Delila （Del） gene in tobacco enhances anthocyanin accumulation and abiotic stress tolerance[J]. BMC Plant Biology，2017，17（1）：65-79.
　　[7]刘晓慧，冷平生，胡增辉. 金鱼草丙二烯环化酶基因AmAOC的克隆及表达分析[J]. 分子植物育种，2017，15（9）：3489-3496.
　　[8]燕一波，郭玉双. 金鱼草花青素糖基转移酶基因的克隆及表达特性分析[J]. 热带作物学报，2017，38（6）：1101-1105.
　　[9]李兆婷. 金鱼草养分吸收积累规律及遗传转化体系初探[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2016.
　　[10]李丹丹，夏 淋，王国伟，等. 激素对金鱼草茎尖快繁及对后期叶序形成的影响[J]. 安徽农业大学学报，2013，40（5）：871-874.
　　[11]李成慧，唐 蓉，朱廣慧，等. 金鱼草组织培养技术研究[J]. 金陵科技学院学报，2013，29（2）：76-78.
　　[12]李竹英，钱艳红，毛绍春. 不同激素对金鱼草茎尖组织培养效果初探[J]. 北方园艺，2006（3）：130-131.
　　[13]谷 旭，刘 洋，高迎秋，等. 金鱼草嫩茎组织培养及无性系建立的研究[J]. 广西农业科学，安徽农业大学学报，2008，39（5）：569-572.
　　[14]赵 静，胡增辉，冷平生，等. 两个金鱼草品种香气成分分析[J]. 北京农学院学报，2013，28（3）：24-28.
　　[15]Dudareva N，Nurfitt L.M，Mann CJ，et al.Developent regulation of methyl benzoate biosynthesis and emission in snapdragon flowers[J]. The Plant Cell，2000（12）：949-961.
　　[16]孙丽萍，衣彩洁，温永刚. 3种生长调节剂对金鱼草穴盘苗生长调控作用[J]. 北京农学院学报，2017，32（1）：64-68.
　　[17]翟玉莹，李 新，梅发博，等. GA3和6-BA对金鱼草生长及生理特性的影响[J]. 安徽农业科学，2015，43（28）：60-62.
　　[18]刘紫微，蒋亚蓉，雷 蕾，等. 消毒时间、光照和温度对金鱼草种子萌发的影响[J]. 北方园艺，2015（18）：88-91.
　　[19]朱广慧，唐 蓉，邓 波，等. 不同品种切花金鱼草对低温胁迫的生理响应及抗寒性分析[J]. 北方园艺，2013（23）：100-102.
　　[20]张瑜瑜，李 晶，吴 旭，等. 金鱼草切花瓶插生理和保鲜效应研究[J]. 北方园艺，2013（9）：154-159.
　　[21]孙正海，辛培尧，林开文，等. 中药材浸提液对金鱼草切花瓶插寿命的影响[J]. 江苏农业科学，2012，40（1）：225-228.
　　[22]高 琼，吕炯璋. STS预处理对切花金鱼草瓶插生理的影响[J]. 山西农业大学学报（自然科学版），2011，31（1）：53-56.
　　[23]杨佩斯，董 乐，叶字海. 红龙草色素的提取工艺优化及其稳定性研究[J]. 安徽农业科学，2017，45（10）：97-100.
　　[24]赵珍珍. 红肉火龙果色素提取工艺优化及其化学成份分析[D]. 福州：福建农林大学，2012.
　　[25]黄韬睿，王 鑫，孟 甜. 天然色素替代亚硝酸盐在腊肉着色和护色中的应用研究[J]. 食品科技，2019，44（2）：134-137.
　　[26]刘海灵，刘 媛，王香凤. 天然紫草素在纺织印染领域的研究进展[J]. 针织工业，2018（10）：41-44.
　　[27]舒冠雄，贾 佳，孙 虎，等. 天然色素的应用及发展[J]. 中国食品工业，2017（4）：64-66.
　　[28]昝立峰，王更先，叶 嘉，等. 黄刺玫花色素的提取工艺优化及其稳定性[J]. 江苏农业科学，2017，45（22）：221-224.
　　[29]徐 飞，钮福祥，孙 建，等. 冷冻对甘薯紫色花青素提取的影响[J]. 江苏农业科学，2018，46（24）：214-216.
　　[30]房照龙，扈本荃. 现代提取技术在天然色素领域的应用[J]. 广州化工，2018，46（8）：21-23.
　　收稿日期：2019-09-27
　　基金项目：广东新安职业技术学院药品生物技术特色专业建设项目（编号：2017YJZJ003）。
　　作者简介：刘秋华（1978—），女，山东兖州人，博士，讲师，主要从事食品、药品生物技术领域的研究。E-mail：lqhnj@163.com。
　　通信作者：王廷芹，博士，副教授，主要从事园艺栽培生理研究。E-mail：wtqin@163.com。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15121735.htm