接骨木叶粗多糖提取工艺研究

来源:用户上传      作者: 刘莹,赵杰,孙延芳

　　摘要：以水为溶剂提取接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）叶粗多糖，利用苯酚－硫酸比色法测定粗多糖的含量，设计单因素试验考察提取温度、提取时间、料水质量比、乙醇浓度、提取次数以及提取液ｐＨ对多糖提取率的影响，并应用正交试验优化提取工艺。结果表明，优化的提取工艺为提取温度７５ ℃、提取时间３ ｈ、料水质量比１∶３０、乙醇体积分数８０％，此条件下接骨木叶粗多糖的提取率为１５．５２％。
　　关键词：接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）；粗多糖；提取；优化
　　中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－0994-03
　　
　　Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｒｂｅｒｒｙ Ｌｅａｖｅｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
　　
　　ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ，ＳＵＮ Ｙａｎ－ｆａｎｇ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｘｉｎ １２３０００，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ） ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ７５ ℃； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， 3 ｈ； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， １∶３０； Cｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ（volumn ratio）， ８０％， ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ １５．５２％．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　　
　　接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）为忍冬科接骨木属植物，又名续骨木、大接骨丹、公道老、扦扦活、马尿骚等，分布于中国东北、华北、华东、华中、云南等地区［１－３］。接骨木化学成分复杂，药理作用广泛，临床用于治疗骨质疏松和促进骨折愈合疗效显著，是一种很有开发价值的中药材［４－１０］。多糖是其主要的药用成分之一，具有抗感染、抗凝血、抗放射以及降血脂的功能，能够有效地控制细胞分裂和分化，调节细胞生长与衰老［１１－１５］。本研究以水为溶剂提取接骨木多糖，并用苯酚－硫酸比色法测定多糖含量，对接骨木叶粗多糖的提取条件进行了优化，以期为接骨木有效成分的开发利用提供理论依据。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 试验材料
　　本试验采用阜新地区的接骨木，２０１０年９月采集，选择无病虫害的叶片，清洗干燥后备用。浓硫酸、苯酚、蔗糖等试剂均为分析纯，购于沈阳国药公司。７５２紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）、高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）、冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司中佳分公司）、组织捣碎机（上海嘉定粮油仪器有限公司）。
　　１．２ 方法
　　１．２．１ 标准曲线的制作 取１０支试管，配制蔗糖含量分别为０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ μｇ／ｍＬ的蔗糖溶液，然后向试管内加入１ ｍＬ体积分数为９％的苯酚溶液，振荡摇匀，再从管液正面以５～２０ ｓ的速度向液面逐滴加入５ ｍＬ浓硫酸，继续振荡摇匀，直至溶液完全混合，颜色均匀。比色液总体积约为８ ｍＬ，在恒温下放置３０ ｍｉｎ，显色，然后以蒸馏水为参比，在４８５ ｎｍ波长下测定吸光度，绘制标准曲线［２，３］。得到蔗糖含量（Ｘ//μｇ/ｍＬ）对吸光度Ａ４８５ ｎｍ（Ｙ）的直线回归方程Ｙ＝０．０１７ ５Ｘ＋０．０３６ ９，相关系数Ｒ２＝０．９９４，说明在所取的浓度范围内蔗糖浓度和吸光度呈良好的线性关系。
　　１．２．２ 接骨木叶多糖提取工艺流程 取备用的接骨木叶，经脱脂、脱色、脱蛋白等处理，然后采用水提醇沉法提取多糖，絮状沉淀经乙醇、乙醚、丙酮洗涤后冷冻干燥，得到粗多糖。
　　１．２．３ 单因素试验 分别考察提取温度、提取时间、料水质量比和乙醇体积分数对多糖提取率的影响［４］。①提取温度。精确称取１．０ ｇ脱脂接骨木叶粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸馏水，调节ｐＨ至７．０，分别在６５、７５、８５、９５ ℃的恒温水浴中提取２ ｈ，过滤、收集上清液，测定其Ａ４８５ ｎｍ，根据标准曲线方程计算溶液中多糖的浓度，并计算接骨木叶粗多糖的提取率（粗多糖提取率＝提取所得粗多糖的质量／脱脂接骨木粉末质量×１００％）。②提取时间。精确称取１．０ ｇ脱脂接骨木叶粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸馏水，调节ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒温水浴中分别提取１、２、３、４、５ ｈ后过滤，收集上清液，测定其Ａ４８５ ｎｍ，计算接骨木叶粗多糖的提取率。③料水质量比。精确称取１．０ ｇ脱脂接骨木叶粉末５份，分别加入１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ蒸馏水，调节ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒温水浴中提取２ ｈ后过滤，收集上清液，测定其Ａ４８５ ｎｍ，计算接骨木叶粗多糖的提取率。④乙醇体积分数。精确称取１．００ ｇ脱脂接骨木叶粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸馏水，７５ ℃恒温水浴中提取２ ｈ，水浴后过滤，收集上清液，减压浓缩，分别加入体积分数为５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇溶液，在４ ℃下沉淀过夜后３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃去上清液，收集沉淀，真空干燥，称取所得粗多糖的质量，计算粗多糖得率。
　　１．２．４ 正交试验［５］ 结合单因素试验结果，设计Ｌ９（３４）正交试验，对影响粗多糖得率的提取温度、提取时间、料水质量比和乙醇体积分数４个因素进行优化。正交试验因素与水平见表１。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 单因素试验结果
　　２．１．１ 提取温度对接骨木叶粗多糖提取率的影响 在６５～７５ ℃的温度范围内，粗多糖提取率随着提取温度的升高而升高，提取温度为７５ ℃时，粗多糖提取率最高，提取温度高于７５ ℃时，粗多糖提取率随温度的升高而下降（图１）。可见较高的提取温度有利于多糖的溶出，但过高的温度会使粗多糖降解，反而不利于提高提取率。

　　２．１．２ 提取时间对接骨木叶粗多糖提取率的影响 在２ ｈ内，粗多糖提取率随着提取时间的延长而升高，但当提取时间超过２ ｈ时，提取率随着时间的延长缓慢下降（图２），可能是因为接骨木叶中的多糖充分溶出之后，再增加提取时间会导致溶液中的多糖降解，从而使提取率下降。
　　２．１．３ 料水质量比对接骨木叶粗多糖提取率的影响 接骨木叶粗多糖的提取率先随溶剂水用量的增加而增加（图３），在料水质量比为１∶２５时粗多糖提取率达到最大，此时大部分多糖已溶出，再增加水的用量，多糖提取率增加不明显，甚至有所降低，且不利于后续试验操作。
　　２．１．４ 乙醇体积分数对接骨木叶粗多糖提取率的影响 醇沉时使用的乙醇体积分数对粗多糖提取率有较大影响（图４）。粗多糖提取率先随乙醇体积分数的增加而升高，在乙醇体积分数为８０％时粗多糖提取率最高。乙醇体积分数为９０％时粗多糖提取率反而有所降低。其原因可能是较高的乙醇溶液浓度有利于多糖的沉淀，但浓度过高会导致部分多糖分子与醇溶蛋白相结合，从而溶于乙醇溶液中，不被沉淀，同时一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加，共同导致了粗多糖提取率的降低。
　　２．２ 正交试验结果
　　根据正交试验结果（表２），各因素对接骨木叶粗多糖提取率的影响顺序为提取温度、提取时间、乙醇体积分数、料水质量比，提取率最高的试验组合为Ａ１Ｂ３Ｃ２Ｄ２，即提取温度７５ ℃、料水质量比１∶３０，提取时间３ ｈ、乙醇体积分数８０％，在此条件下进行验证试验，所得多糖提取率为１５．５２％，高于正交试验组合，说明正交试验结果是可靠的。
　　３ 结论
　　以粉碎脱脂后的接骨木叶为原料，以水为溶剂提取粗多糖，设置单因素试验和正交试验优化提取工艺，结果表明，在提取温度７５ ℃、提取时间３ ｈ、料水质量比１∶３０、乙醇体积分数８０％的条件下，提取接骨木叶粗多糖，提取率可达１５．５２％。
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