扶正颗粒剂提取工艺的研究
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【摘要】目的：优化扶正颗粒剂的提取工艺。方法：应用正交实验筛选扶正颗粒剂原药材提取工艺的最佳条件，以黄芪甲苷为指标，采用HPLC-蒸发光散射检测器进行测定。结果：扶正颗粒剂的醇提最佳工艺为A2B1C3D3即70%乙醇溶液，6倍加液量，每次提取2小时，回流提取3次。
【关键词】扶正颗粒剂；正交设计；提取工艺
扶正颗粒剂属于院内制剂，原处方由黄芪、当归、枸杞和陈皮四味中药组成，临床上用于提高放化疗后肿瘤患者血中的白细胞数，以提高机体免疫力，从而降低放化疗毒副作用。原剂型为汤剂。为实现规模化生产，方便肿瘤患者用药，拟将其改为颗粒剂。文献资料报道，黄芪含有黄芪多糖、黄芪甲苷、氨基酸、蛋白质、胡萝卜素、胆碱、叶酸、亚油酸等多种成分[1]。有补气升阳,固表止汗,托疮生肌,利水退肿之功效[2]。当归含有藁苯内酯类及其异构物、香豆素类、黄酮类以及有机酸类等[3]。具有抗血栓、改善血液循环、抗炎、镇痛、利胆保肝等多种作用[4]。枸杞含有枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素、维生素C、多种氨基酸及微量元素，具有滋补肝肾、益精明目、润肺、调节免疫，提高视力，提高造血能力，抗衰老，抗诱变，降糖降血脂等作用。陈皮含有挥发油、黄酮类、有机胺类和微量元素等，具有理气健脾、燥湿化痰、双向调节胃肠运动、抗溃疡、保肝、利胆、祛痰、平喘等作用。
黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，现代药理研究表明，黄芪甲苷具有改善白细胞变形能力、改善心肌收缩舒张功能、促进胰岛素分泌和清除自由基等药理作用。所以实验中以黄芪甲苷为指标采用正交实验对扶正颗粒剂的醇提工艺进行了筛选。
1 仪器与试药
1.1药材：黄芪、当归、枸杞、陈皮 均购于怡生堂药业有限责任公司
1.2试剂：
正丁醇（天津市风船化学试剂科技有限公司 批号080912）
氨水 （天津市风船化学试剂科技有限公司 批号090118）
甲醇 （天津威晨化学试剂科贸有限公司 批号080509）
无水乙醇 （天津市化学试剂三厂 批号090512）
黄芪甲苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司）
1.3仪器：
旋转蒸发仪RE-52A上海亚荣生化仪器厂
DZHW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)
电子天平 AB135-S （METTLER TOLEDO）
大连依利特p230高效液相色谱仪 EC2000色谱工作站
蒸发光散射检测器 ELSD800(Alltech)
色谱柱 E1720833（SinoChromODS-BP4.6mm*200mm依利特）
2 实验方法及结果
2.1考察因素及水平根据有关文献报道[5]，扶正颗粒剂醇提工艺的考察因素为：乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数，每个因素设计三个水平，见表-1。
表－1 扶正颗粒剂醇提工艺正交试验考察因素与水平表
2.2样品液的制备根据扶正颗粒剂原处方称取样品9份，每份含黄芪150g,当归75g,枸杞50g,陈皮30g.按照正交试验L9(34)表的条件安排试验，经提取得9份样品提取液，在80℃水浴上，浓缩，定容到1000ml，再用移液管移取50ml,回收溶剂并蒸干，残渣加水20ml,微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇萃取4次，每次80ml,合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次80ml,弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容到5ml容量瓶中，备用。
2.3扶正颗粒剂黄芪甲苷的含量测定
2.3.1测定方法的选择因黄芪甲苷无紫外吸收或紫外吸收较弱，所以采用HPLC-蒸发光散射检测法进行含量测定。
2.3.2对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品5.26mg,用甲醇定容至5ml,超声3min,摇匀，分别精密量取上述溶液0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、1ml置于1ml容量瓶中，用甲醇定容。
2.3.3标准曲线的绘制将上述标准品系列溶液，分别用微孔滤膜过滤，弃去初滤液，收集续滤液于EP管中，进样20μl，每份进样2次，以乙腈-水=36：64为流动相，气体压力3.0MPa，检测器漂移管温度70℃，以均峰面积为纵坐标，黄芪甲苷浓度为横坐标做线性回归（如表-2、图-1所示），得回归方程：y=1027.1x-29.349 R2=0.9996。黄芪甲0.1052mg/ml～1.052mg/ml的浓度范围内呈良好线性关系。
表-2 黄芪甲苷标准曲线测定值
图-1黄芪甲苷标准曲线
2.3.4样品液的含量测定将上述提取的9份样品液，用微孔滤膜过滤，弃去初滤液，收集续滤液于EP管中，进样10μl，以乙腈-水=36：64为流动相，气体压力3.0kpa，检测器温度70℃，测定扶正颗粒剂原药材中的黄芪甲苷的含量。结果见表-3。
表-3 正交试验设计表及实验结果
结果表明：各因素的影响规律为D > C > B > A，最佳工艺条件为 A2B1C3D3，即70%乙醇溶液，6倍加液量，回流提取3次，每次提取2小时。将表-3数据经统计学处理后进行方差分析，结果见表-4。
表-4方差分析表
方差分析结果表明：各因素水平之间无显著性差异。
3 结果
结合直观分析结果和方差分析结果，扶正颗粒剂醇提的最佳工艺条件为：A2B1C3D3，即扶正颗粒剂原药材中加入6倍量70%乙醇回流提取3次，每次提取时间为2小时。
4 讨论
实验过程中有几个问题需要我们应注意：（1）在提取过程中要注意各实验组的平行性，例如：浸泡时间，加热时的电压，提取的时间等。（2）药材提取后需趁热过滤，原因为黄芪甲苷在热乙醇和热水中溶解，冷后易析出。（3）在用饱和正丁醇萃取过程中有时有乳化层出现，原因可能是正丁醇没有充分饱和。（4）在用氨试液洗涤时，应保持时间一致，否则可能出现黄芪甲苷衍生物的转化程度不同。
参考文献
[1]云秦川, 中药黄芪的药理研究进展[J]内蒙古中医药，2004（6）：p33.
[2]董鹏达,郭宪清.黄芪的临床应用进展[J].中国医药论坛,2006,4(4):p9
[3]王芳,李东.当归的化学成分及药理研究进展[J].中国药房,2003,14(10):p630-631
[4]陈慧珍, 当归的研究进展[J]海峡学报，2008，20（8）：p84.
[5]吴永平,曹园,曹正中.黄芪活性成分最佳提取工艺探讨[J].时珍国医国药,2001,12(10):p876-877
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