响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺及其抗氧化作用

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　　摘要：考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等单因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响，采用响应面Box-Behnken Design优化辽东楤木总皂苷的提取工艺，并对辽东楤木总皂苷进行提取量测定及抗氧化作用的研究。响应面法最终优化结果表明，乙醇体积分数为85%，液料比为20 mL ∶ 1 g，超声时间为60 min，在此条件下测得辽东楤木中总皂苷类提取量为94.93 mg/g，与预测值良好吻合。抗氧化活性结果表明，辽东楤木总皂苷类对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH）自由基和2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），简称ABTS]自由基均有较好的清除能力，当总皂苷的质量浓度为 57.83 mg/mL 时，对DPPH自由基的清除率最大，为92.17%;而对ABTS自由基的清除能力在总皂苷质量浓度为19.28～96.39 mg/mL 范围内逐渐增强，当其质量浓度为96.39 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为100%。
　　 关键词：辽东楤木;响应面法;总皂苷;提取工艺;DPPH自由基;ABTS自由基;清除率;抗氧化作用
　　 中图分类号： R284.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）03-0204-05
　　 辽东楤木[Aralia elata（Miq.）Seem.]别称龙牙楤木、刺龙牙、刺嫩芽、刺老鸦、东北野香椿等，是一种食药兼用型的五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia）植物，为多年生落叶灌木或小乔木[1]。在亚洲地区分布广泛，我国主要分布在辽宁、吉林、黑龙江等地的山区，尤其在长白山地区以及小兴安岭一带分布最为广泛;在日本、朝鲜和俄罗斯的西伯利亚地区分布也相对较多[1-2]。传统中医药记载其主要药用部位为树皮和根皮，具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效，可用于风湿性关节炎、肾气不足等症的辅助治疗[3-4]。现代研究表明，辽东楤木中主要含有皂苷类、氨基酸类、油脂类、黄酮类以及一些微量元素等化学成分，其中现代文献对总皂苷类成分的研究最为广泛，目前已经分离出了皂苷的多种苷元[5-8]。此外，对于辽东楤木药理作用的研究也较丰富，辽东楤木可以刺激肾上腺皮质系统而具有一定的抗炎作用，尤其对缓激肽介质的合成与释放有明显的抑制作用，临床上还用于治疗肾虚阳痿、气虚无力等症[4，9-10]。通过对辽东楤木总皂苷提取工艺的优化以及抗氧化作用的研究，为辽东楤木保健产品的开发研究提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料、仪器与试剂
　　辽东楤木嫩芽样品采于辽宁省丹东市，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia Linn.）辽东楤木[Aralia elata （Miq.） Seem]的芽，低温烘干，粉碎并过60目筛备用。
　　主要仪器有UV-1500型紫外-可见分光光度计，购自翱艺仪器（上海）有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，购自常州赛普实验仪器厂;AR2140电子分析天平，购自奥豪斯仪器（上海）有限公司;KQ5200DB型数控超声波清洗器，购自昆山超声仪器有限公司;101型电热鼓风干燥箱，购自北京市永光明医疗仪器有限公司;HP-01无油真空泵，购自邦西仪器科技（上海）有限公司。
　　主要试剂有齐敦果酸对照品（批号为110709-200304）、DPPH试剂（批号为6KCYN-LT）、ABTS試剂（批号为619H032）、L（+）-抗坏血酸，均购于中国药品生物制品检定所，对照品纯度达到98%以上;高氯酸、香草醛、冰乙酸、二氯甲烷、乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取齐敦果酸对照品适量，加入甲醇制成含有1.002 mg/mL齐敦果酸对照品溶液[11]。
　　1.2.2 标准曲线的制备 精确吸取齐敦果酸对照品溶液40、60、80、100、120 μL，置于5 mL的容量瓶中，挥干溶剂，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度[12]。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度（y）测定，以测得的吸光度（y）为纵坐标、对照品的质量（x）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y=8.384 5x-0.010 22，r=0.999 9，线性范围为0.04～0.12 mg。测定结果见表1。
　　1.2.3 单因素对总皂苷提取量的影响试验 通过单一变量分别考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响，以获得单因素影响提取工艺的最佳范围[13]。
　　1.2.3.1 乙醇体积分数对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置于具塞锥形瓶中，精确加入70%、75%、80%、85%、90%乙醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率 100 W）60 min，放冷，再称定质量，用相应体积分数的乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入5 mL 0.4%香草 醛- 冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于 60 ℃ 水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定，并测定不同乙醇浓度下的总皂苷提取量。
　　1.2.3.2 超声提取时间对总皂苷含量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置具塞锥形瓶中，精确加入85%的乙醇30 mL，密塞，称定质量，分别选取35、50、65、80、95 min等5个时间点进行超声处理（功率100 W），放冷，再称定质量，用85%乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入 0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光值测定，并测定不同超声时间的总皂苷提取量。 　　1.2.3.3 液料比对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置于具塞锥形瓶中，精确加入85%乙醇各15、20、25、30、35 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W）60 min，放冷，再称定质量，用85%乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定，并测定不同液料比的总皂苷提取量。
　　1.2.4 响应面法优化提取总皂苷类工艺的试验设计 根据单因素的试验结果，选取超声时间、液料比、乙醇体积分数等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素，进行3因素3水平的响应面设计，设计的因素及水平见表2。
　　1.2.5 辽东楤木总皂苷的抗氧化试验
　　1.2.5.1 辽东楤木总皂苷对1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH自由基）清除能力的测定
　　1.2.5.1.1 DPPH工作液的制备 精确称取DPPH固体适量，置于250 mL量瓶中，用无水乙醇进行定容，摇匀，制成质量浓度为10 mg/mL的DPPH工作液。
　　1.2.5.1.2 辽东楤木总皂苷清除DPPH自由基的测定方法 分别精确吸取DPPH工作液4 mL和不同质量浓度的总皂苷溶液2 mL置于试管中，混合均匀后在室温下避光处理60 min，然后在波长为 517 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;再分别精确吸取 4 mL 无水乙醇和不同质量浓度的2 mL总皂苷溶液，按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL DPPH工作液和2 mL无水乙醇作为空白对照，按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的测定，以L（+）-抗坏血酸作为阳性对照。DPPH自由基清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%[14-16]。
　　1.2.5.2 辽东楤木总皂苷对ABTS自由基清除能力的测定
　　1.2.5.2.1 ABTS工作液的制备 称量386 mg的ABTS用蒸馏水溶解后，定容至100 mL;再称取 376.8 mg 的过硫酸钾用蒸馏水溶解后，定容至 25 mL;取100 mL ABTS溶液和4.6 mL过硫酸钾溶液混合，使ABTS溶液的浓度为7 mmol/L，过硫酸钾溶液的浓度为2.45 mmol/L，以上2种溶液混合后于室温下避光处理16 h，使用前用无水乙醇进行进行稀释，使其在波长为734 nm处的吸光度值在0.7左右[17]。若在ABTS工作液中加入辽东楤木的总皂苷溶液后，吸光度下降，说明该溶液对ABTS自由基存在清除作用，否则反之。
　　1.2.5.2.2 辽东楤木醇提物清除ABTS自由基的测定方法 精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液，并将其置于试管中混合均匀，在室温下避光处理60 min，然后在波长为 734 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;分别精确吸取4 mL无水乙醇和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液，按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL无水乙醇作为空白对照，按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的測定，以L（+）-抗坏血酸作为阳性对照。ABTS自由基清除率=[D0（D1-D2）]/D0×100%[18]。
　　2 结果与分析
　　2.1 单因素试验结果与分析
　　2.1.1 不同体积分数乙醇对总皂苷提取量的影响 在超声提取时间为60 min、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下，不同乙醇浓度对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图1。辽东楤木总皂苷提取量随着乙醇体积分数的增加先升高再降低，当乙醇体积分数升至85%时，辽东楤木总皂苷提取量达到最大;当乙醇体积分数大于85%时，总皂苷提取量急剧降低。根据提取化学成分相似相容的原理，结合辽东楤木总皂苷含有的化学成分类型，将乙醇体积分数控制在75%～85%。
　　2.1.2 超声提取时间对总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下，不同超声提取对辽东楤木总皂苷提取的影响见图2。超声提取时间在35～65 min范围内，辽东楤木总皂苷提取量呈升高趋势，在65 min时达到最大值，再增加提取时间，总皂苷提取量降低。随着提取时间的延长，总皂苷不断被提取出来，65 min后总皂苷提取量降低，一方面可能是总皂苷发生水解、结构发生变化，另一方面提取出来的其他成分影响总皂苷的提取量，因此提取时间应控制在50～80 min。
　　2.1.3 液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、超声提取时间为65 min的条件下，不同液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图3。液料比从15 mL ∶ 1 g增大到20 mL ∶ 1 g时，由于浓度差异扩大导致辽东楤木总皂苷向溶液迅速渗透，使其提取量显著增加;在（25～35） mL ∶ 1 g液料比的范围内，对辽东楤木总皂苷的提取量影响不大，液料比应控制在（15～25） mL ∶ 1 g。
　　2.2 响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺试验结果
　　2.2.1 响应面设计方案与结果 在单因素试验考
　　察的基础上，依据Box-Behnken中心设计原理，确定响应面分析的因素和水平，选择超声时间（x1）、液料比（x2）、乙醇体积分数（x3）等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素，辽东楤木总皂苷提取量为响应值进行考察。运用Design-Expert 8.0.5软件进行响应面设计和分析，对辽东楤木总皂苷提取工艺进行优化，试验结果见表3。 　　 运用Design-Expert 8.0.5软件，得出辽东楤木总皂苷提取量与超声时间（x1）、液料比（x2）、乙醇体积分数（x3）之间的回归方程：y=5 662.82+15.49x1-14.79x2-148.44x3-0.099x1x2+0.027x1x3-0.23x2x3-0.12x21+0.80x22+0.95x23（r2=0.997 9，r2a=0.995 2）。回归分析及方差分析结果见表4。
　　 回归方程的P<0.01，说明本试验采用的回归模型具有统计学意义;失拟项的P值为0.974 8>0.05，说明回归模型无失拟因素的存在，拟合程度相对较好，可反映出总皂苷的提取量与液料比、超声时间、乙醇浓度之间的关系，说明响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺的可行性。通过对试验结果的拟合分析，得出最佳的提取工艺：液料比为 20 mL ∶ 1 g，超声时间为58.97 min，乙醇体积分数为84.95%，总皂苷提取量的预测值为 95.34 mg/g。根据影响因素的实际情况，可将提取工艺调整为液料比20 mL ∶ 1 g，超声时间60 min，乙醇体积分数85%。在此条件下对辽东楤木药材进行提取工艺的验证，测得平均总皂苷提取量为 94.93 mg/g，实测值与预测值的偏差为0.43%，体现回归方程具有较好的可行性。
　　2.2.2 辽东楤木总皂苷提取工艺的验证 称取 1.0 g 辽东楤木粉末，精确称定，置于具塞锥形瓶中，精确加入20 mL 85%乙醇，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W）60 min，放冷，再称定质量，用85%乙醇补足失质量，摇匀，滤过，取续滤液20 μL，按照标准曲线的制备方法进行测定。根据上述方法测得辽东楤木总皂苷的提取量为94.93 mg/g，且方法学考察的各项指标均符合要求，测定结果见表5。
　　2.3 辽东楤木总皂苷的抗氧化活性
　　2.3.1 辽东楤木总皂苷对DPPH自由基的清除能力 辽东楤木总皂苷对DPPH自由基有一定的清除作用，表现出较强的抗氧化能力，但与对照药物抗坏血酸相比，辽东楤木总皂苷的抗氧化能力要弱于抗坏血酸。总皂苷溶液的质量浓度在0.1～0.4 mg/mL范围内时，总皂苷质量浓度的变化对DPPH自由基清除率的影响较大，当总皂苷质量浓度为0.4 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为 87.30%;而总皂苷质量浓度在大于0.4 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率变化平缓，清除能力达到最高极限，测定结果见图4。
　　2.3.2 辽东楤木总皂苷对ABTS自由基的清除能力 辽东楤木总皂苷清除ABTS自由基的能力随总皂苷溶液质量浓度的增加而增强;不同质量浓度抗坏血酸清除ABTS自由基的能力恒定，但辽东楤木总皂苷溶液清除ABTS自由基的能力弱于抗坏血酸。总皂苷溶液的质量浓度在0.1～0.6 mg/mL范围内，对ABTS自由基的清除能力与质量浓度呈正相关;当质量浓度大于 0.6 mg/g 时，对ABTS自由基的清除率升高趋势变缓;总皂苷质量浓度为1.0 mg/g时，清除率达到最大值，为96.07%（图5）。
　　3 结论
　　通过响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺的最终工艺为液料比20 mL ∶ 1 g，超声时间 60 min，乙醇体积分数85%。在此条件下， 测得辽东楤木总皂苷提取量为94.93 mg/g，实测值与模型预测值无显著差异，说明该方法稳定可靠，为准确测定辽东楤木中总皂苷提取量奠定了基础。辽东楤木中总皂苷抗氧化作用的研究表明，总皂苷具有较强的抗氧化能力，综合比较辽东楤木总皂苷与抗坏血酸分别清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，总皂苷与抗坏血酸的抗氧化作用有一定的差异，但作为一种天然来源的抗氧化剂，总皂苷具有较好的抗氧化活性。该研究可为辽东楤木保健产品的进一步开发研究提供科学依据[19]。
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