响应面法优化牛蒡根总黄酮超声波提取工艺

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　　摘要：以新鲜牛蒡根为原料，采用超声波辅助提取牛蒡根中总黄酮，在单因素试验基础上，采用 Box-behnken试验设计和响应面分析法，探讨料液比、提取温度、乙醇体积分数和提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响。结果表明，优化的牛蒡根总黄酮超声波法提取工艺为乙醇体积分数61 %，料液比1∶23（g∶mL），提取温度60 ℃，提取时间59 min，在此条件下总黄酮提取率为27.96 mg/g。
　　关键词：牛蒡根；总黄酮；超声波；提取率；响应面优化
　　中图分类号：TQ461 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.05.044
　　Abstract：On the basis of single factor experiments，the effects of solid-liquid ratio， extraction time，ethanol concentration and extracting temperature on extraction rate were investigated by taking burdock root as the raw material and using ultrasonic to assist in extracting the total flavonoids in burdock root. The best extraction process of the total flavonoids in burdock root was optimized and determined by the response surface methodology based on Box-Behnken experimental design. The results showed that，the optimum preparation processes for extract was establised as follows：ethanol concentration 61%，extracting temperature 60 ℃，solid-liquid ratio 1∶23（g∶mL）and the extraction time 59 min. Under these conditions，the optimum yield of total flavonoids was 27.96 mg/g.
　　Key words：burdock root；total flavonoids；ultrasonic；extraction；response surface methodology
　　牛蒡（Arctium lappa L.），又名惡实、大力子、东洋参，又名东洋牛鞭菜等，主要分布于中国、西欧、克什米尔地区、欧洲等地。我国牛蒡的种植地主要分布于江苏省和山东省，尤以江苏省的徐州丰县、沛县，山东省的苍山种植历史悠久、面积规模较大[1]。牛蒡根中含有许多药用成分，如小分子的挥发油、多酚类、黄酮类化合物[2]、醛类，以及多炔类物质，如绿原酸、牛蒡甙、木脂素等[3-4]，其具有多种药物作用及保健功效，特别是对心脑血管保护、抗氧化、抗衰老 、抗菌及抗病毒、保护肝肾胃肠损伤、抗疲劳 、抗肿瘤、抗突变、调节糖代谢和脂代谢紊乱、免疫调节、抗炎 、调整肠道菌群、润肠通便和预防男性疾病等方面都具有一定的作用[5]。已有相关研究表明，黄酮类化合物具有降血脂、降血压、抑制血小板聚集、镇痛等多种药理作用及保健功效，是一种特别有开发意义的保健品原材料[6]。
　　超声波产生的机械振动和强烈的空化效应会破坏细胞的结构，能够加速目标成分的溶出。超声波辅助提取不仅能缩短提取时间，还避免了高温对有效成分的破坏[7]。试验在超声波辅助前提下研究了提取牛蒡根总黄酮的影响因素，优化了牛蒡根总黄酮的提取工艺条件，为牛蒡根黄酮的开发和利用提供了研究的基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与仪器
　　牛蒡根，徐州大自然公司提供；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所提供；NaNO2、无水乙醇、Al（NO3）3、NaOH 等试剂，均为分析纯。
　　QE-5A型高速中药粉粹机，武义县屹立工具有限公司产品；CPA225D型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；101A-4型电热鼓风恒温干燥箱，上海康路仪器设备有限公司产品；KQ-100B型超声波清洗器，巩义市予华仪器有限责任公司产品；L5S型紫外可见分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 牛蒡根的预处理
　　将新鲜的牛蒡根清洗干净、切片，并用0.75%维C溶液浸泡30 min，沥干水分后于40 ℃条件下鼓风干燥至恒质量，粉粹过60筛，得牛蒡根干粉，低温冷冻储存以备用。
　　1.2.2 黄酮含量的测定
　　黄酮含量的测定采用NaNO2-Al（NO3）3法[8]。以芦丁为标准品，制作标准曲线，得到吸光度与黄酮质量浓度的方程：
　　Y=0.012 1X+0.029 8，R2=0.999 0.
　　将0.5 mL牛蒡根总黄酮提取液加入到25 mL比色管中，再加5%的NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min，最后加入4% NaOH溶液4.0 mL，用纯水定容至25 mL刻度，在室温下静置15 min后，于波长509 nm处测定处吸光度，并将其代入标准曲线，求得比色管中牛蒡根总黄酮的质量浓度，计算牛蒡根总黄酮的提取率。
　　1.2.3 总黄酮提取单因素试验
　　（1）料液比对牛蒡根中总黄酮提取率的影响。选取料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25， 1∶30（g∶mL），在超声功率100 W，乙醇体积分数60%，提取时间30 min，提取温度40 ℃条件下，研究料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响。 　　（2）乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响。分别选用体积分数为20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液作为溶剂，在超声功率100 W，提取时间30 min、料液比1∶20（g∶mL），提取温度40 ℃条件下，研究乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响。
　　（3）提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响。选择提取时间分别为20，30，40，50，60，70 min，在超声功率100 W，提取温度40 ℃，乙醇体积分数60%，料液比1∶20（g∶mL）条件下，研究提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响。
　　（4）提取温度对牛蒡根总黄酮得率的影响。选取提取温度30，40，50，60，70，80 ℃，在超声功率100 W、乙醇体积分数60%，料液比1∶20（g∶mL），提取时间30 min条件下，研究不同提取温度对牛蒡根总黄酮提取率的影响。
　　1.2.4 响应面设计
　　在单因素试验的基础上，以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度为考查因素，牛蒡根总黄酮的提取率为响应值进行Box-Behnken的中心组合设计（四因素三水平）。通过Design Expert 10.0.3 软件进行数据分析和试验设计，优化牛蒡根总黄酮在超声波辅助下的提取条件。
　　Box-Behnken 的中心组合因素水平见表1。
　　2 结果与分析
　　2.1 单因素试验结果分析
　　2.1.1 料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响
　　料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图1。
　　由图1可知，料液比为1∶10 ～ 1∶20（g∶mL）时，黄酮提取率随料液比的增加而增加；料液比为1∶20时，总黄酮提取率达到最大；料液比超过1∶20时，提取率反而下降。这是由于随着溶剂与原料的比值增大浓度差也就增大，这虽然促进了传质的过程，但是当比例过大时，影响了超声波产生的效应，使得黄酮提取率不增加反而下降[9]。因而，最适料液比选择为1∶20（g∶mL）。
　　2.1.2 乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响
　　乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图2。
　　由图2可知，牛蒡根总黄酮提取率随乙醇体积分数的增加先增加后急速降低，当乙醇体积分数为80%时，其提取率最高，此结果与蔡茜彤等人的研究结果一致；现有研究表明[10]，植物中的黄酮类化合物主要以苷元和苷类的形式存在，高体积分数的乙醇更适于黄酮苷元的提取，而低体积分数的乙醇（60%以下）适于黄酮苷的提取。这也说明牛蒡根中黄酮苷元比黄酮苷类含量更高，因此最佳的乙醇体积分数选为80%。
　　2.1.3 提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响
　　提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图3。
　　由图3可知，在60 min以内，牛蒡根总黄酮提取率随着提取时间的延长而增大；而60 min以后，其随时间的增加而减少，由此确定最佳提取时间为60 min。由于细胞的破裂和黄酮类物质的溶出都需要时间，黄酮类物质随着提取时间的增加提取也越充分，但是时间过长，超声波巨大的机械能会破坏黄酮类物质，而使黄酮类物质提取率下降[11]。
　　2.1.4 提取温度对牛蒡根总黄酮提取率的影响
　　提取温度对牛蒡根总黄酮得率的影响见图4。
　　由图4可知，提取温度在30～60 ℃时，黄酮提取率迅速增加；但当提取温度大于60 ℃時，黄酮提取率随温度的增加反而降低，呈现先增加后减小的趋势。这主要是因为升高的提取温度，增大了扩散系数，降低了提取液黏度，加快了分子热运动的速度，从而促进了物质的溶出。但温度过高，会破坏牛蒡根总黄酮的组织结构，使其被氧化分解，同时，溶剂会随温度的升高而损失，杂质溶出也会大量增加，而使总黄酮的提取率降低[12]。由此，牛蒡根总黄酮最适提取温度为60 ℃。
　　2.2 响应面试验结果分析
　　2.2.1 响应面结果
　　根据Box-Beknhen 中心组合试验设计，以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间为考查因素，在单因素基础上进行了四因素三水平的响应面试验设计。
　　响应面试验设计见表2。
　　利用Design Expert 10.0.3 软件对表2中的试验数据进行了多元回归拟合，并对影响牛蒡根总黄酮提取的因素进行条件优化，得到牛蒡根总黄酮提取的回归方程：
　　Y=27.82+1.72A-0.91B-0.35C+0.33D-0.05AB+
　　0.31AC-0.24AD-0.12BC-0.072BD-0.57CD-
　　3.22A2-1.58B2-1.50C2-0.21D2.
　　2.2.2 响应面分析
　　对响应面试验结果进行方差分析。
　　方差分析见表3。
　　由表3可知，该回归模型的p<0.001，为极显著水平，相关系数R2=0.928 5，说明自变量和响应值之间、预测值与试验值之间有显著的关系，试验模型与实际试验能较好的拟合。而且失拟项p=0.534 8> 0.05，差异不显著，试验误差小，这说明该模型能较好的拟合牛蒡根总黄酮提取率的实际值与预测值。变异系数（CV%）为2.34%，较小，说明试验结果重复性较好。从检验值F可以看出，影响牛蒡根中总黄酮提取率的因素的主次顺序为料液比（A）>乙醇体积分数（B）>提取温度（C）>提取时间（D），其中乙醇体积分数、乙醇体积分数的二次项、料液比、料液比的二次项、提取温度的二次项都是极显著水平，而其他的则不显著。
　　料液比和乙醇体积分数的交互影响见图5，料液比和提取温度的交互影响见图6，提取时间和料液比的交互影响见图7，乙醇体积分数和提取时间的交互影响见图8，提取温度和提取时间的交互影响见图9，乙醇体积分数和提取温度的交互影响见图10。 　　由图5 ～图10 可知，响应面图呈现凸状，开口朝下，并且有最高点，且从最高点向四周边缘逐渐下降，这表明各因素作用增大时，响应面值也增大，达到最高点后，各因素作用增大，响应面值反而减小[13]。
　　2.2.3 验证试验
　　经过Design Expert 10.0.3软件进行分析，牛蒡根总黄酮在超声波功率为100 W辅助提取下的最优提取条件为料液1∶23.48（g∶mL），提取温度60.05 ℃，乙醇体积分数61.05%，提取时间59.03 min，从该条件得出的牛蒡根总黄酮提取率为28.19 mg/g。为了方便实际操作，将各因素稍作调整，分别取整数为料液比1∶23（g∶mL），提取温度60 ℃，乙醇体积分数61%，提取时间59 min，该条件下测得的牛蒡根总黄酮提取率为27.96 mg/g，和理论值比较，相对误差为0.82%，试验值与理论值能够吻合较好。说明该模型对牛蒡根总黄酮提取条件拟合较好，得到的优化条件可行。
　　3 结论
　　以牛蒡根为原料，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化提取条件，得出超声功率为100 W时的牛蒡根中总黄酮的最佳提取条件为料液比 1∶23（g∶mL），乙醇体积分数61%，提取温度 60 ℃，提取时间59 min，在此条件下，得到牛蒡根总黄酮提取率为 27.96 mg/g。研究结果表明，牛蒡根中总黄酮含量丰富，是黄酮提取的良好原材料，具有较好的开发潜能，为进一步研究牛蒡黄酮提供了理论基础。
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