响应面法优化高压脉冲电场辅助酶解河蚌肉工艺

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　　摘 要：为研究河蚌肉酶解制备复合调味料工艺，采用高压脉冲电场辅助酶解，提高氨基态氮得率。以水解度为检测指标，通过单因素试验研究复合酶种类、温度、反应时间、pH值、酶类配比、酶添加量、液料比、脉冲数和电场强度对水解度的影响;在单因素试验基础上，采用响应曲面法优化高压脉冲电场辅助酶解河蚌肉工艺。结果表明：酶解河蚌肉的最佳条件为木瓜蛋白酶、风味蛋白酶质量比1.71∶1、酶添加量1.6%、温度50 ℃、反应时间4.5 h、pH值6.74、电场强度18.85 kV/cm、液料比50（V/m）、脉冲数8，最终水解度为42.75%，水解度较对照组（36.23%）提高18.0%。
　　关键词：河蚌肉;酶解;高压脉冲电场;响应面优化
　　中图分类号：TS254.9                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）02-0025-07
　　Abstract： High-voltage pulsed electric field-assisted enzymatic hydrolysis was applied to the preparation of composite seasoning from freshwater mussel meat for improve yield of amino nitrogen. The effects of enzyme types and combinations， temperature， reaction time， pH value， enzyme dosage， solid-to-liquid ratio， pulse number and electric field intensity on the degree of hydrolysis were investigated by one-factor-at-a-time method. Subsequently， the selected variables were optimized by response surface methodology. Results showed that the optimum conditions were as follows： papain/flavourzyme ratio 1.71：1， enzyme dosage 1.6%， temperature 50 ℃， reaction time 4.5 h， pH 6.74， electric field strength 18.85 kV/cm， solid-to-liquid ratio 50 （V/m）， and pulse number 8. Under these conditions， the degree of hydrolysis was 42.75%， which was increased by 18.0% compared with 36.23% for the control group.
　　河蚌是一种贝壳类水生动物，可产珍珠，是中国特有资源[1]，来源广泛，价格低廉，营养价值高。河蚌肉含有丰富的蛋白质、糖类、维生素和矿物质（铜、锌），具有高蛋白质、低脂肪的特点[2]，营养价值和药用价值丰富[3]，且蚌肉的营养成分易溶于汁液，易于被人体消化吸收[4]。王素雅等[5]测定河蚌的基本营养成分，利用酶法制备河蚌功能性产品;郭福军等[6]研究河蚌酶解液美拉德反应前后风味成分的变化;史万忠等[7]研究河蚌多糖粗提物的分级醇沉及其活性;Almonacid等[8]对商业消毒蚌肉的工艺收率进行研究;Silva等[9]研究蚌肉酶解的优化条件。
　　本研究主要探究酶解河蚌肉制备调味料工艺，采用高压脉冲电场（pulsed electric field，PEF）辅助酶解，提高氨基态氮得率，从而制备营养、风味俱全的复合调味料。PEF辅助酶解的主要原理为：物料细胞膜在电场作用下被击穿，促使细胞内容物渗出，提高酶与底物的接触机会[10];适宜的电场强度能改变酶的结構，从而使其活性中心暴露出来，酶活性升高[11];河蚌蛋白在适宜的电场强度下变得松弛，增加与酶的接触机会，加速酶解[12]。近几年来，针对PEF的研究主要涉及高压脉冲的杀菌作用、对微生物、酶的影响和功能物质的提取等方面[13-14]。不少学者研究了PEF技术对于食品新鲜度的保持及对营养成分的影响效果，近年来有望实现工业化应
　　用[15]。Rahbari等[16]研究高压电场解冻对鸡胸肉蛋白特性的影响;Ding Changjiang等[17]研究高压电场辅助冷冻豆腐解冻;Delsart等[18]研究脉冲电场和高压放电对红酒微生物稳定性和品质特性的影响;周亚军等[19-20]利用PEF提取河蚌中的多糖及鱼骨中的钙;张鸣镝等[21]采用PEF破壁法提高了红松籽的抗氧化肽活性;刘铮等[22]采用PEF破壁法提取废啤酒酵母中的蛋白质与核酸。PEF技术在制备氨基态氮方面应用较少，本研究将PEF技术应用于河蚌肉酶解中，得到氨基态氮得率高的酶解液，制备营养、风味俱佳的复合调味料，为河蚌肉的加工与调味料制备提供一种新的方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　松花江野生河蚌，购于长春市扶余市长春岭镇。
　　甲醛、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯） 北京化工厂;风味蛋白酶、木瓜蛋白酶（均为食品级） 广西南宁庞博生物工程有限公司;中性蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、无花果蛋白酶（均为食品级） 南京奥多福尼生物科技有限公司。 　　1.2 仪器与设备
　　PEF系统（频率10～5 000 Hz，处理室体积0.75 mm3） 自制;JJ200电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;THZ-98C恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;TGL-16gR飞鸽牌系列离心机 上海安亭科学仪器厂;SHJ-4B恒温磁力搅拌水浴锅 常州高德仪器制造有限公司;PHSJ-4A实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;XFS-280手提式压力蒸汽灭菌器（规格DN-300） 浙江新丰医疗器械有限公司;ME204/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;HHS-8S電子恒温不锈钢水浴锅 上海宜昌仪器沙筛厂。
　　1.3 方法
　　1.3.1 酶解液制备工艺流程
　　河蚌→清洗匀浆→加酶水解（PEF辅助）→灭酶→离心→酶解液操作要点：1）原料预处理：清洗河蚌肉，去除蚌肉中的沙子和污物，将蚌肉倒入胶体磨中，加入少量水，制成匀浆，将河蚌肉分装入袋，放入冰箱备用;2）PEF处理：将上述混合浆液以10 mL/min流速经蠕动泵送至PEF处理室，在一定电场强度、液料比和脉冲数（个）的条件下进行PEF处理;3）制备酶解液：取40 g河蚌肉，按照4∶1的液料比（V/m）加水溶解，放入锥形瓶中，加入不同种类、一定比例的蛋白酶，调至一定温度和pH值，放入恒温磁力搅拌水浴锅中水浴一段时间;4）离心：反应完成后，放置于室温下冷却，再放入离心机中离心（4 500 r/min、15 min）后取出上层清液，并记录上清液质量;5）分析检测：取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分别取20 mL定容后的溶液放入3 个锥形瓶中，各加入60 mL蒸馏水，空白实验取80 mL蒸馏水于锥形瓶中，用甲醛进行滴定，滴定方法参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》。取滴定结果平均值计算水解度，并作柱状图或折线图，对结果进行分析。
　　1.3.2 指标检测
　　实验以水解度为反应指标，采用甲醛电位滴定法测定离心液中氨基态氮的含量，计算酶解所得蛋白质的质量。水解度按照下式计算。
　　式中：β为水解度/%;n为甲醛电位滴定法测得氨基态氮物质的量/mol;M为氮元素的摩尔质量（14 g/mol）;K为河蚌肉换算系数，根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，河蚌肉换算系数为6.25;m为河蚌肉质量/g;α为河蚌肉中蛋白质含量（7%），测定方法参照GB 5009.5—2016。
　　1.3.3 单因素试验设计
　　取4 g河蚌肉，按照表1的数据，加水溶解，放入锥形瓶中，调节pH值，加入相应的酶，放入恒温磁力搅拌水浴锅中水浴，控制温度;反应完成后，放置于室温条件下冷却，再放入离心机中离心（4 500 r/min、15 min）后取出上层清液，并记录上清液质量;取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分别取20 mL定容后的溶液放入3 个锥形瓶中，各加入60 mL蒸馏水，另取80 mL蒸馏水于锥形瓶中作为对照组，用甲醛进行滴定，计算水解度，并作柱状图或折线图，对结果进行分析。
　　1.3.4 响应面优化试验设计
　　根据单因素试验结果，选择温度、pH值和电场强度3 个影响显著的因素作为响应变量，利用Design-Expert 8.0.5b软件，按照Central Composite的中心组合实验设计原理，以水解度为响应值，通过响应面分析进行酶解条件的优化，得到最优酶解条件。各试验组的编码与取值、因子编码及各变量水平如表2所示。
　　2 结果与分析
　　2.1 酶种类对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.2%、温度55 ℃、pH值6.5、反应时间4 h、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，选用木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶和猕猴桃蛋白酶5 种不同的蛋白酶酶解河蚌肉。
　　由图1可知，加入不同种类的酶，河蚌肉的水解度也不一样。加入木瓜蛋白酶时的水解度最好，其次是风味蛋白酶，无花果蛋白酶、中性蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的酶解效果均不理想，与前2 种酶相差较大。根据刘通
　　讯等[23]对于酶法水解鲢鱼蛋白的研究，复合酶的酶解效果优于单一酶。因此，本研究采用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进行复合酶解，这与郭福军等[6]研究河蚌酶解液美拉德反应前后风味成分的变化实验所用的酶一致。
　　2.2 温度对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、pH值6.5、反应时间4 h、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，将温度分别设定为45、50、55、60、65 ℃酶解河蚌肉。
　　由图2可知，随着温度的升高，河蚌肉水解度呈先上升后下降的趋势，在50 ℃时达到最大，50 ℃以后下降趋势渐渐变缓慢，这是由于温度低于50 ℃时，酶活性随温度升高而增强，而温度高于50 ℃时，随着温度的不断升高酶活性受到抑制，酶解效果越来越差。这与李梅青等[24]超声辅助提取明绿豆中的超氧化物歧化酶工艺，谭秀山等[25]研究鸡肉蛋白质提取条件的优化结果一致。
　　2.3 反应时间对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.2%、pH值6.5、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，将反应时间分别设定为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h酶解河蚌肉。
　　由图3可知：当反应时间小于4.5 h时，河蚌肉水解度随着时间的增加而不断上升;当反应时间大于4.5 h时，河蚌肉水解度随时间的增加呈现缓慢下降的趋势。这可能是由于随着反应时间的不断增加，反应底物和酶不断反应，水解度不断增加;当反应时间大于4.5 h时，酶解效果变化不明显，可能是由于反应底物和酶完全反应，水解度不再发生明显变化，而反应时间过长既浪费能源又可能引发不必要的反应。这与黎英等[26]采用超声波辅助酶法优化提取红腰豆多糖工艺实验中的观点一致。 　　2.4 pH值对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、反应时间4.5 h、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，将pH值分别设定为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5酶解河蚌肉。
　　由图4可知：当pH值小于6.5时，随着pH值的升高，河蚌肉水解度不断上升，且上升趋势不断加快;当pH值大于6.5时，随着pH值的升高，河蚌肉水解度不断降低，这是由于酶需要一个适合的pH值环境，pH值对水解度有很大的影响。这与张辉[27]超声辅助酶解制备麦麸抗氧化肽工艺研究、王丽等[28]酶法制备白鲢鱼蛋白粉研究中的观点一致。
　　2.5 木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.2%、温度50 ℃、pH值6.5、反应时间4.5 h、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，将木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的配比分别设为1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1酶解河蚌肉。
　　由图5可知：随着木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比不断增大，酶解效果先变好后变差，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比为3∶2时，河蚌肉水解度最高，这是由于木瓜蛋白酶与样品的结合能力更强，当木瓜蛋白酶占比逐渐增大时，水解度逐渐增高。当水解度增大到一定程度，由于底物有限，因此水解度受到底物浓度限制而不能继续增大。因此，确定木瓜蛋白酶与风味蛋白酶最佳配比为3∶2。
　　2.6 酶添加量对河蚌肉水解度的影响
　　在木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、pH值6.5、反应时间4.5 h、液料比40、脉冲数800、电场强度25 kV/cm的条件下，将酶添加量分别设定为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%酶解河蚌肉。
　　由图6可知：随着酶添加量的增加，河蚌肉水解度不断上升，且上升趋势逐渐变缓，在酶添加量为1.6%时，河蚌肉水解度达到最大;酶量继续增加，水解度没有太大变化。这可能是由于底物一定时，随着酶添加量的增加，酶解效果不断增加，但酶添加量继续增加时，酶受到底物限制，达到饱和点，并不能与底物继续结合，因此酶解效果变化不明显。这与王丽等[28]酶法制备白鲢鱼蛋白粉研究中的观点一致。因此，初步确定酶最佳添加量为1.6%。
　　2.7 液料比对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、pH值6.5、反应时间4.5 h、脉冲数8、电场强度25 kV/cm的条件下，将液料比分别设定为20、30、40、50、60酶解河蚌肉。
　　由图7可知：当液料比由20逐渐增加时，河蚌肉水解度逐渐增加并趋于稳定;当液料比为50时，河蚌肉水解度最高。这是由于增大溶剂用量时，样品与溶剂充分接触，并充分与酶结合;溶剂用量增加至一定程度，样品与溶剂接触程度足够充分，水解度增加不明显。这与蒋德旗等[29]在响应面优化纤维素酶法提取桂花多糖工艺及其抗氧化活性研究中的观点一致。
　　2.8 脉冲数对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、pH值6.5、反应时间4.5 h、液料比50、电场强度25 kV/cm的条件下，将脉冲数分别设定为6、7、8、9、10酶解河蚌肉。
　　由图8可知：当脉冲数为8时，河蚌肉水解度最高;脉冲数从6增加至8时，水解度逐渐增大;脉冲数从8增加到10时，水解度逐渐降低。这是由于增大脉冲数时，细胞破坏程度增加，细胞内容物易于溶出，但脉冲数增加至一定程度会引起分子破坏，使水解度先增加后降低。这与周亚军等[19]PEF辅助提取河蚌多糖工艺优化研究的结果一致。
　　2.9 电场强度对河蚌肉水解度的影响
　　在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1∶1、温度50 ℃、pH值6.5、反应时间4.5 h、液料比50、脉冲数8的条件下，将电场强度分别设定为15、20、25、30、35 kV/cm酶解河蚌肉。
　　由图9可知：当电场强度为20 kV/cm时，河蚌肉水解度最高;电场强度从15 kV/cm增加至20 kV/cm时，水解度有所增加;电场强度从20 kV/cm增加至35 kV/cm时，水解度逐渐下降。这是由于电场强度增加，细胞孔隙增大，细胞内容物易溶出，易提取细胞内物质，但电场强度增加至某一程度后，介电特性降低，从而水解度降低。这与马飞宇等[30]对于PEF影响果蔬介电特性实验与机理分析的观点一致。
　　2.10 响应曲面法优化试验结果
　　2.10.1 响应面优化方案设计与结果
　　在试验结果的基础上绘制AB、AC、BC的两因素交互作用响应面3D效果图。由图10～12可知，AB、AC、BC的交互作用存在峰值，随着温度、pH值、电场强度的不断增加，河蚌肉水解度呈现先增加后下降的趋势，pH值对水解度影响较大。温度与pH值两因素交互作用的等高线图为圆形，说明AB交互作用不显著。温度与电场强度、pH值与电场强度的交互作用等高线为椭圆，说明AC、BC之间交互作用显著。
　　通过单因素试验找到对河蚌肉水解度影响显著的因素，并用响应面法分析河蚌肉酶解条件，应用Design-Expert 8.0.5b软件为各因素取最优值，分别为A=49.86，B=6.74，C=18.58，转换后得到的最佳提取条件为温度50 ℃、pH值6.74、电场强度18.58 kV/cm，水解度预测值43.26%。对上述实验条件进行验证，得到河蚌肉水解度分别为43.25%、44.14%和43.65%，平均值为42.68%，且重复性较好。
　　3 結 论
　　经优化后的河蚌肉酶解条件为酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶配比1.71∶1、温度50 ℃、pH值6.74、反应时间4.5 h、液料比50、脉冲数8、电场强度18.85 kV/cm。经优化后的酶解条件可使河蚌肉水解度达42.75%，较对照组的36.23%提高18.0%。 　　参考文献：
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