酶法提取余甘子总多酚的研究

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　　【摘 要】 目的：采用酶法优选余甘子多酚类化合物的提取工艺。方法：在单因素试验的基础上，采用正交设计进行提取条件的优化，以总多酚的提取率为考察指标，采用福林-酚比色法进行总多酚的含量测定，确定了提取工艺的最佳参数。结果：确定余甘子中总多酚的最佳提取工艺为：温度60℃，料液比为1∶30 ，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶[KG-*3/5]1，总加酶量为2%，pH值为4.0，恒温振荡（低速r=60～100/min），提取时间4h，总多酚提取率为13.68%。结论：酶法提取优于传统溶剂提取法，操作简单可行，为余甘子总多酚的提取工艺提供了参考。
　　【关键词】 余甘子;总多酚;纤维素酶;果胶酶;正交设计
　　【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）3-0036-05
　　Abstract：Objective To optimize the extraction process of polyphenols from Fructus Phyllanthus by enzymatic method.Methods Based on the results of single factor test，we designed the orthogonal experiment to optimize parameters.The content of total polyphenols was used as the investigation index and determined by Folin phenol colorimetric method，then obtain the optimum parameters of the extraction process.Results The optimum extraction process of total polyphenols was as follows： the temperature at 60℃，the ratio of liquid to material in 30∶[KG-*3/5]1，the proportion of cellulase with pectinase about 1∶[KG-*3/5]1，with the amount of adding enzyme 2%，and pH at 4.0， finally， extracting at constant temperature and constant shaking conditions（r=60～100/min） for 4h， so the total polyphenol yield was 13.68%.Conclusion The enzymatic extraction was better than the traditional solvent extraction method，besides the operation was simple and feasible，and the experimental result provide a reference for the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus.
　　Keywords：Fructus Phyllanthus;Total Polyphenols;Cellulase;Pectinase;Orthogonal Design
　　余甘子，为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，为常用藏药，同时具有较高营养价值，位列国家卫计委首批药食同源中药名单。其含有没食子酸、鞣花酸等多酚类主要药用成分，具有降血糖、抗氧化等药理活性，在糖尿病、肝病等方面发挥重要作用[1]。因此，藏医药经典著作《蓝琉璃》记载“治尿频”，《晶珠本草》记载“治赤巴病”[2-3]，在三果汤、十八味诃子利尿丸等藏成药中应用[4-5]。目前，余甘子多采用传统溶剂提取法[6-7]，以甲醇等有机溶剂作为提取溶剂，提取温度过高造成鞣花酸等有效成分活性降低，提取率较低。针对植物细胞壁是由果胶质、纤维素、半纤维素等构成的复杂致密结构的特点[8-11]，以纯化水作为提取溶剂，利用纤维素酶、果胶酶将余甘子细胞壁中纤维素、果胶质等成分降解，从而达到破坏细胞壁致密结构的目的。该方法提取余甘子总多酚，操作简单，安全环保，旨在探索一种新的余甘子总多酚提取方法。
　　1 仪器与材料
　　V-1100D型可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）;PHS-3S型精密PH计（成都世纪方舟科技有限公司），BSA124S型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;SHA-C恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）;福林-酚试剂（浓度2mol/L ，成都科隆化学品有限公司，批号：2018042701）;纤维素酶 （酶活力>150U/mg上海源聚生物科技有限公司，批号：171016），果胶酶（酶活力>50U/mg 上海源聚生物科技有限公司，批号：170925）。没食子酸对照品（含量≥99%，成都德思特生物技術有限公司，批号：DST180226-008）。余甘子药材（批号：20151101，购自成都市国际商贸城药材市场）经成都中医药大学赖先荣教授鉴定为大戟科植物余甘子的干燥成熟果实。其他试剂和药品均为分析纯。
　　2 方法与结果
　　2.1 福林-酚法测定余甘子总多酚
　　2.1.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品，精密称定，置50mL量瓶中，加30%甲醇使溶解并稀释至刻度线，摇匀，制成每1mL含有没食子酸316μg的对照品溶液。 　　2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取余甘子提取液1.0mL，水浴蒸干，残渣加30%甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加30%甲醇至刻度线，摇匀，即得。
　　2.1.3 标准曲线的制作 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL、5.5mL、6.0mL，分别至10mL量瓶中，加30%甲醇至刻度线，得到每1mL分别含有94.8、110.6 、126.4、142.2、158.0、 173.8 、189.6μg没食子酸的溶液。分别吸取以上稀释后的对照品溶液1.0mL置25mL具塞试管中，加5mL纯化水，摇匀，加入1mL福林-酚试剂，放置5min，加4mL14%碳酸钠溶液，再加纯化水至刻度，摇匀，室温避光放置2h。同时，以30%甲醇溶液代替对照品溶液为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》四部通则0401），在754nm的波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。结果，得到标准曲线，A=0.0049C-0.1843，R2=0.999，当没食子酸质量浓度在94.8～189.6μg / mL时，吸光度与没食子酸质量浓度呈良好的线性关系。
　　2.1.4 方法学考察 取没食子酸对照品溶液按“2.1.3”项下的方法进行配制和测定，重复测定6次，记录吸光度（A），计算其RSD值为2.03%，表明仪器精密度较好。取余甘子提取液按“2.1.2”项下制备6份，同上进行测定，记录A值并代入标准曲线计算，得到平均含量为102.4mg/g，含量的的RSD值为2.08%，表明方法重复性良好。将制备的同一供试品溶液于2h、4h、6h、8h、10h、12h，进行测定，计算得A的RSD值为0.86%，说明供试品溶液12h内具有良好的稳定性。参照《中国药典》2015版第四部9101指导原则，进行加样回收试验。取9份已知含量的供试品溶液0.15mL（供试品溶液含5g药材，药液体积150mL），分别加入相当于余甘子总多酚含量的50%、100%、150%的没食子酸对照品。同上方法测定，计算加样回收率，加样量与结果见表1，表明加样回收结果良好。
　　2.2 单因素考察试验
　　2.2.1 酶的种类和比例的选择 按照表1所列，精密称定各组所需酶。取余甘子粗粉5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，分别加入各组相应的酶，加pH值已调至4.0的纯化水（用1mol/L NaOH和1mol/L HCL溶液调节）100mL，60℃水浴加热2h，滤过，滤液转移至100mL量瓶，并用pH值为4.0的纯化水稀释至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率（提取率=余甘子总多酚含量/余甘子粗粉质量*100%）。结果见表2，当纤维素酶和果胶酶比例为1∶[KG-*3/5]1时，加酶组3的提取率最高。因此选择纤维素酶和果胶酶比例为1∶[KG-*3/5]1。
　　2.2.2 提取时间对余甘子总多酚提取率的影响 取余甘子粗粉5g，精密称取，置于圆底烧瓶中，加入纤维素酶、果胶酶各0.05g，再加pH值调至4.0的纯化水100mL，60℃水浴加热，加热时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h，滤过，滤液转移至100mL量瓶，并用以上溶剂稀释至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率。结果，各个提取时间对应的提取率分别为0.64%、2.66%、2.81%、3.32% 3.86%、3.92%，提取时间在3h后，提取率趋于稳定，表明余甘子的最佳提取时间为3～4h。
　　2.2.3 温度对余甘子总多酚提取率的影响 取余甘子粗粉5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入纤维素酶、果胶酶各0.05g，再加PH值调至4.0的纯化水100mL，分别置于30℃、40 ℃、50 ℃ 、60℃、70 ℃ 温度下水浴加热4h，滤过，滤液转移至100mL量瓶，并用以上溶剂稀释至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率。结果，各个温度下的提取率依次为3.60%、3.66%、3.73%、3.80%、3.70%，可以看出无明显差异。
　　2.2.4 pH值对余甘子总多酚提取率的影响 取余甘子粗粉5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入纤维素酶、果胶酶各0.05g，再分别加入（用1mol/L NaOH和1mol/L HCL溶液调节）pH值至3.6、4.0、4.5、5.2、5.6、6.2的純化水100mL，60℃水浴加热4h，滤过，滤液转移至100mL量瓶，加入以上相应的溶剂至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率。结果，提取率依次分别为3.00%、3.30%、3.89%、3.69%、3.61%、3.38%，表明在pH值在4.5左右时，提取率最高。
　　2.2.5 料液比对余甘子总多酚提取率的影响 取余甘子粗粉5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入纤维素酶、果胶酶各0.05g，再分别加入已调至pH值为4.5的纯化水50、75、100、150、200、250mL，60℃水浴加热4h，滤过，滤液转移至100mL量瓶，并用以上溶剂稀释至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率。结果，提取率分别为2.80%、4.65%、5.36%、6.97%、8.46%、7.91%，表明当料液比为1∶[KG-*3/5]40时，余甘子得到充分提取，总多酚提取率最大。
　　2.2.6 酶的用量对余甘子总多酚提取率影响 取余甘子粗粉5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，分别加入为余甘子粗粉质量1%、2%、3%、4%、5%、6% 的酶（纤维素酶：果胶酶=1∶[KG-*3/5]1），再分别加入已调至pH值为4.5的纯化水200mL，60℃水浴加热4h，滤过，滤液转移至200mL量瓶，并用以上溶剂稀释至刻度线。按照“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算余甘子总多酚提取率。结果，提取率分别8.65%、9.42%、9.28%、9.36%、8.49%、8.39%，表明提取余甘子总多酚的最佳酶用量为2%～4%。 　　2.3 正交试验 在单因素试验的基础上，考察各因素之间的相互影响，选用5因素4水平进行L16（45）正交实验，进一步确定提取余甘子总多酚提取的最佳条件，因素水平见表3，实验结果见表4、极差分析见表5、方差分析见表6。
　　由表4、5中的极差分析和方差分析可以得出，影響余甘子总多酚提取率的因素的主次D>C>E>B>A 。以温度A为误差项进行方差分析，因素D料液比对提取效果有显著影响，因素B、C、E对提取效果无显著性影响。综合分析最佳的提取组合为A4 B4 C1D3E2 ，最佳的提取工艺为：提取温度60℃、提取时间4h、pH为4.0、料液比为1∶[KG-*3/5]30、酶用量为2%，结果与单因素考察结果一致，最佳提取率为10.42%。
　　在正交试验的基础上，对余甘子进行了振荡提取的初步研究。采用水浴恒温振荡器，60℃条件下考察了振荡转速对余甘子提取结果的影响。结果低速（r=60～100/min）条件下，振荡均匀，提取率为13.5%;中速（r=100～200/min）条件下，振荡幅度较大，提取率低于低速条件下的提取;高速（r=200～300/min）条件下，振荡剧烈药材粗粉大部分粘在容器壁，提取不充分，提取率忽略不计。综合考虑，选择低速（r=60～100/min）进行验证实验。
　　2.4 验证实验 经过“2.2”“2.3”的单因素考察和正交实验可以得出提取余甘子的最佳酶解工艺，现对最佳的工艺条件进行验证。按照以上条件，对加酶组、不加酶组、加酶振荡组（r=60～100/min）各平行提取3份，进行分析比较。结果见表7。
　　由表6可知，各组的余甘子总多酚提取率一致。与未加酶组相比，加酶组的提取率提高了27%，加酶振荡组提高了64%，加酶振荡组比加酶组提高了29%。可见，加酶组的提取效果较好，加酶振荡的动态提取更有利于余甘子总多酚的提取。
　　3 讨论
　　纤维素酶和果胶酶可以降解植物细胞中纤维素和果胶质等成分，从而破坏植物细胞壁，发挥生物催化作用。而酶催化需要特定的温度和pH环境。本研究参考了纤维素酶和果胶酶的生物酶提取技术[12-16]和热动力学理论研究[17-19]的相关文献，得到纤维素酶和果胶酶提取黄酮类和多酚类成分的最适温度为30～60℃，最适pH值在4～6。在一定温度范围内，酶的催化效果随温度升高而增强，超过一定温度后，酶的结构被破坏，活性减弱或消失。同时，酶的催化活性也需要在最适的pH值环境下，过酸或过碱的环境同样破坏酶的结构，影响研究结果。因此，以上讨论与研究结果最终选择60℃、pH值4.0为提取条件相吻合。在本次研究中，余甘子依靠纤维素酶和果胶酶的催化作用，总多酚的提取率有了提高，此外借助水浴恒温振荡器的机械力，使提取溶剂与药材充分接触，反复振荡使整个过程处于一个小型的动态循环之中，进一步的促进了余甘子总多酚的溶出。
　　余甘子为药食同源类中药，主要含有多酚类化合物，不仅可以发挥其广泛的药理作用，还能发挥多种营养保健作用，应用于食品等领域[20-22]。本次研究中，利用纤维素酶和果胶酶提取主要成分，绿色环保可食用，希望为余甘子在食品和药品领域的充分利用发挥一定的参考价值。
　　参考文献
　　[1]赵生玉，黄浩洲，姜红，等.基于化学分析与抗氧化活性的余甘子提取工艺效果对比[J].中华中医药杂志，2019，34（2）：796-800.
　　[2]第司·桑结嘉措.蓝琉璃[M].毛继祖等，译校.上海：上海科学技术出版社，2012：381-382.
　　[3]帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科学技术出版社，1986：76.
　　[4]王文军，丁一，窦芳，等.藏药三果汤散化学成分、质量控制及药理作用研究概况[J].中国药房，2019，30（4）：556-559.
　　[5]梁沛余，段路路，吴穹.藏药十八味诃子利尿丸对糖尿病大鼠的保护作用[J].中国老年学杂志，2019，39（1）：141-144.
　　[6]李伟，朱华伟，陈运娇，等.余甘子不同溶剂提取物抗炎活性的研究[J].天然产物研究与开发，2018，30（3）：418-424，443.
　　[7]宋琳琳，沙靖全，张磊，等.余甘子中总黄酮提取工艺研究[J].辽宁中医药大学学报，2016，18（4）：42-44.
　　[8]于敬，周晶.生物酶解技术在中药提取中的应用[J].现代药物与临床，2010，25（5）：340-344.
　　[9]宋成英.酶解技术在中药提取中的应用研究[J].时珍国医国药，2013，24（8）：1934-1935.
　　[10] 纪学慧，张华.酶技术在中药成分提取分离中的应用[J].中华中医药学刊，2011，29（10）：2365-2367.
　　[11]吴卫，唐振祥，李素珍.酶解法辅助提取钩藤中钩藤碱的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（10）：23-25.
　　[12]陈建福，曾勤，吴丽敏，等.纤维素酶辅助提取柚叶总黄酮的工艺研究[J].食品研究与开发，2018，39（17）：25-30.
　　[13]石松标，周妙玲，莫红玲，等.超声波辅助纤维素酶解法优化毛果鱼藤总黄酮的提取工艺及抗氧化活性[J].食品科技，2018，43（8）：215-221.
　　[14]高建德，朱晓玉，宋开蓉，等.星点设计-效应面法优化果胶酶酶解提取枸杞总黄酮的工艺[J].中药材，2017，40（2）：421-424.
　　[15]刘汉珍，史亚东，俞浩，等.超声-果胶酶协同提取滁菊总黄酮的工艺研究[J].中药材，2016，39（12）：2820-2822.
　　[16]于跃，张剑.纤维素酶降解纤维素机理的研究进展[J].化学通报，2016，79（2）：118-122，128.
　　[17]高霞，刘聪燕，陈彦，等.酶技术在中药黄酮类成分研究中的应用[J].中草药，2014，45（16）：2412-2417.
　　[18]李金花. 纤维素酶降解纤维素的热动力学研究[D].曲阜：曲阜师范大学，2005.
　　[19]李凤艳，王凯，朱鹏，等.复合酶法优化提取银杏叶总黄酮的工艺研究[J].中国现代中药，2018，20（9）：1142-1145.
　　[20]杨冰鑫，刘晓丽.余甘子总多酚的提取及其抗氧化活性研究[J/OL].食品工业科技：1-14[2019-07-03].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.ts.20190430.1409.022.html.
　　[21]曹波，何绍志，金文洁，等.余甘子的营养价值及加工利用现状研究[J].现代食品，2019（4）：1-4.
　　[22]甘瑾，何钊，张弘，等.余甘子果渣多酚提取工艺优化及其抗氧化活性分析[J].食品工业科技，2019，40（12）：171-177.
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