黄芩炭止血作用与吸附力的相关性研究
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作者:赵玉升 赵金莉 刘楚妤
摘要：目的 探索黄芩炭（Charred Radix Scutellariae，CRS）体内止血作用与体外吸附力之间的相关性。方法 利用小鼠断尾出血模型和肝脏出血模型，以出血时间为指标，评价市售黄芩炭（CRS-SH）和马弗炉烧制品（250℃，300℃，350℃）对止血效果的影响;以紫外-可见分光光度法测定各组黄芩炭对亚甲基蓝的吸附力。结果 在小鼠断尾出血实验和肝脏出血实验中，与生黄芩（SB）组比较，黄芩炭均能显著减少出血时间（P<0.01），且随着马弗炉烧制温度的增高，出血时间减少，出血时间长短顺序为：SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350;吸附力实验结果显示，吸附力大小顺序为：CRS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。在一定范围内，黄芩炭的止血作用随着吸附力的增大而增大，两者呈正相关，相关系数大于0.97。结论 黄芩炭止血作用与吸附力的相关性良好，吸附力的大小可以反映止血作用的强弱，该研究为黄芩炭质量控制的体外评价方法提供了实验依据。
关键词：黄芩炭;止血作用;吸附力
【Abstract】Objective：To study the correlation between the hemostatic effect of Charred Radix Scutellariae（CRS）in vivo and the adsorption capacity in vitro. Methods：The mouse tail bleeding model and liver bleeding model were used to evaluate the hemostatic effect of commercially available CRS-SH and muffle furnace burned products（250℃，300℃ and 350℃）with bleeding time as the index. The UV-Vis spectrophotometric method was used to determine the adsorption of methylene blue by CRS in each group. Results：In the mouse tail bleeding experiment and the liver bleeding experiment，when compared with the raw scutellaria baicalensis（SB）group，the CRS could significantly reduce the bleeding time（P<0.01），and with the increase of the muffle furnace firing temperature，the bleeding time reduced. The order of bleeding time was as SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350. The results of the adsorption force experiment showed that the order of adsorption force was as CRS-350>CRS-300>CRS- 250>CRS-SH>SB. Within a certain range，the hemostatic effect of CRS increased with the increase of the adsorption force，and the two were positively correlated，and the correlation coefficient was greater than 0.97. Conclusion：The hemostatic effect of the CRS has a good correlation with the adsorption force. The size of the adsorption force can reflect the strength of the hemostatic effect. This study provides an experimental basis for the in vitro evaluation method of the quality control of the CRS.
【Key words】Charred Radix Scutellariae，hemostatic effect，adsorption force
黃芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi.简称SB）的干燥根，始载于《神农本草经》，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效[1]。黄芩制炭后，其止血作用增强[2-3]，黄芩炭（Charred Radix Scutellariae.简称CRS）主要用于血热导致的吐血、衄血、血崩等各种出血症[3]。而有关黄芩炭的炮制方法的研究很少，现今中医药理论对于黄芩炭“烧炭存性”的标准一直停留在传统经验的判断上。据文献报道[4]，黄芩炒炭后吸附力明显增加，推测是其产生止血的主要原因，但是到目前为止，对于止血作用与吸附力的相关性研究报道较少。本文将研究黄芩、市售黄芩炭和马弗炉闷煅法不同温度炮制的黄芩炭，其吸附力大小与止血效果之间的相关性，以期为黄芩炭质量控制的体外评价方法提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 紫外分光光度计（CECI，英国，CECI公司）;马弗炉（TL0612，北京中科（中国澳博科技股份有限公司）;高速万能粉碎机（PFT-100A，温岭市林大机械有限公司），水浴锅（HH-1，金坛市画成开元实验仪器厂），电子分析天平（SA1245-CW，北京赛多利斯科学仪器有限公司，），涡旋混合器（QL-901，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9240B，上海森信实验仪器有限公司），亚甲基蓝为分析纯（北京索莱宝科技有限公司，批号220D029） 1.2 材料 黄芩、市售黄芩炭购于北京仟草中药饮片有限公司;生理盐水购于石家庄四药有限公司;白眉蛇毒血凝酶购于锦州奥鸿药业有限公司，水合氯醛购于国药集团化学试剂有限公司;乙醇和其它分析级化学试剂均购于北京化学试剂公司。所有实验用水均为去离子水。
1.3 动物 SPF级昆明小鼠，雄性，体重（30±2）g，购于北京斯贝福生物技术有限公司。实验期间动物均饲养于同一环境下，保持室温（25±1）℃左右，空气湿度55%～65%，环境安静，动物随意进食进水，明、暗12 h循环饲养。所有动物在实验前24 h禁食不禁水。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 烧制黄芩炭溶液制备 每次称取黄芩生药100 g，放于坩埚中，铝箔纸密封并加盖于马弗炉中烧制。马弗炉程序升温：第一阶段5 min升温至70 ℃，保温20 min;第二阶段 25 min升温至250℃（300℃，350℃），保温1 h。获得的黄芩炭分别命名为CRS-250，CRS-300，CRS-350，将称量好的黄芩放置在中药粉碎机中粉碎。称取粉末50 g，放置在十倍去离子水中用水浴锅加热，温度设定为100℃，时间为1 h。用滤纸粗过滤残渣，再使用0.22 μm的微孔滤膜过滤残渣，合并3次滤液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液于4℃保存，留置待用。
2.1.2 黄芩生药与市售黄芩炭溶液制备 每次称取黄芩生药与市售黄芩炭（CRS-SH）100 g，将称量好的黄芩与市售黄芩炭放置在中药粉碎机中粉碎。称取粉末50 g，放置在十倍去离子水中用水浴锅加热，温度设定为100℃，时间为1 h。用滤纸粗过滤残渣，再使用0.22 μm的微孔滤膜过滤残渣，合并3次滤液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液于4℃保存，留置待用。
2.2 止血作用的研究
2.2.1 试药配制 样品的制备：将2.1中获得的浓缩液放置于蒸发皿上烘干，精密称取粉末，加入去离子水制备成质量浓度为1 mg/mL的溶液，备用。
阳性药的配制：取白眉蛇毒凝血酶粉末0.5 KU，加入5 mL质量浓度为9 g/mL的氯化钠溶液，摇匀，使其完全溶解，制得浓度为0.1 KU/mL的阳性药溶液，避光保存，备用。
麻醉剂：精密称量4.0 g水合氯醛粉末，倒入磨口具塞三角瓶中，加入100 mL去离子水，震荡使完全溶解，备用。
2.2.2 小鼠断尾出血实验 取健康昆明小鼠35只，称重并标号，随机分成七组，每组5只，分别为生理盐水组（NS），白眉蛇毒血凝酶阳性药组（HC，白眉蛇毒血凝酶0.1 KU/mL，0.67 KU/Kg），生黄芩组（SB），黄芩炭炒制组（CRS-SH），黄芩炭不同制备温度组（CRS-250组，CRS-300组，CRS-350组），给药剂量为0.5 mL/30 g。动物适应性饲养一段时间后开始给药，阳性药组皮下注射给药，其余各组均腹腔注射给药。给药后小鼠自由活动1 h，然后用4%水合氯醛对小鼠进行麻醉。用洁净的手术剪在距离小鼠尾尖1 cm处将小鼠尾尖剪断，诱导出血，每隔30 s，使尾尖出血处接触滤纸片，观察出血情况，以出血开始到出血停止的时间记为出血时间，记录实验结果。
2.2.3 小鼠肝脏出血实验 分组和给药同上述断尾出血实验。将小鼠麻醉后，用手术剪将小鼠沿腹中线剪开，暴露肝脏。用生理盐水浸润的纱布将小鼠的肝脏垫起。用2 mL注射器针头在小鼠肝脏刺深度为2 mm的创口，按下秒表开始计时，每隔30 s用生理盐水浸润的小滤纸片蘸一次伤口，直至滤纸片上没有血迹，从扎破肝脏开始出血到停止出血的时间记为出血时间，记录实验结果。
2.3 统计方法 采用SPSS25.0统计软件，所有试验数据以（x±s）表示，统计学处理采用方差分析。单因素ANOVA分析方法用于实验数据服从正态分布，同时方差齐。组间差异则运用LSD方法统计。P<0.05表示实验数据之间差异有统计学意义，P<0.01 表示差异有显著统计学意义。
2.4 实验结果
2.4.1 黄芩炭的外观性状 马弗炉烧制的3个不同温度的黄芩炭、生黄芩、市售黄芩炭的外观性状，结果见图1。由图1可知，市售黄芩炭与马弗炉不同温度烧制的黄芩炭颜色质地差别明显。随着温度的升高，黄芩炭的炭化程度加深，顏色越来越深，而炭化产率逐渐降低（CRS-250的产率69.5%，CRS-300的产率56.3%，CRS-350的产率44.93%）。
2.4.2 出血实验结果 在小鼠断尾出血和肝脏出血实验中，与生理盐水组比较，阳性药组和生黄芩组、各组黄芩炭均能显著减少出血时间（P<0.01），结果见表1。在小鼠断尾出血实验中，HC组与CRS-350组没有显著性差异，CRS-SH组与CRS-250组、CRS-300组没有显著性差异。在小鼠肝脏出血实验中，HC组与各黄芩炭组均没有显著性差异，CRS-350组与HC组、CRS-300组没有显著性差异。这表明，CRS-300组与CRS-350组在小鼠肝脏出血实验中具有较好的止血作用，CRS-350组在小鼠断尾出血实验中有较好的止血作用，综合两个实验，CRS-350组的止血效果更明显。实验表明小鼠断尾出血和肝脏出血模型的出血时间大小排列顺序一致，为：SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350。
2.5 吸附力的测定
2.5.1 亚甲基蓝中水分的测定 取亚甲基蓝约0.2 g，置于已在105℃干燥至恒重的扁形锥形瓶中，精密称定，于105℃干燥 5 h 后，测定其水分。结果表明亚甲基蓝的含水量为 10.62%。
2.5.2 亚甲基蓝标准溶液的配制 取亚甲基蓝约0.17 g，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加入pH≈7的磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释至刻度，按公式计算，得含亚甲基蓝干燥品浓度为1.5306mg/mL的亚甲基蓝对照品母液，再从中精密量取1.4 mL至100 mL量瓶中，加pH≈7的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，制成每1 mL含0.02143 mg的亚甲基蓝标准溶液，即得。 其中：C1——以干燥品计算的亚甲基蓝溶液的浓度
m——未干燥的亚甲基蓝的质量
E——亚甲基蓝的水分
V——溶液体积
2.5.3 供试品溶液的制备 取2.2.1中制备的SB、CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350粉末，各约0.1 g，精密称定，置100 mL磨口具塞锥形瓶中，精密加入浓度为0.02143mg/mL的亚甲基蓝溶液20 mL，置恒温振荡器上，室内环境温度控制在25℃左右，振荡器转速为150r/min，震荡40min，滤过，即得。
2.5.4 方法学考察
2.5.4.1 线性关系考察 精密移取亚甲基蓝标准溶液0 mL，0.5 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，分别置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀。以第一份溶液为空白，在665nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，亚甲蓝的量为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为：Y=9.1634X+0.0176，r=0.999，表明亚甲基蓝在0.010715 mg～0.10715 mg之间呈良好的线性关系（表2）。
2.5.4.2 精密度试验 精密量取亚甲基蓝标准溶液3 mL置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸盐缓冲溶液至刻度，取该溶液连续测定6次，RSD为0.21% 表明本方法精密度良好（表3）。
2.5.4.3 重复性试验 取2.2.1中制备的CRS-SH粉末 0.1 g，按2.5.3 项下方法制备供试品溶液6份，以PBS缓冲溶液为空白对照，在665 nm处测定吸光度，带入标准曲线计算供试品溶液中游离的亚甲基蓝量，并根据吸附力=吸附量/样品量，计算出吸附力。重复性结果表明CRS的平均吸附力为1.253，RSD为0.29%，结果表明本方法重复性良好（表4）。
2.5.4.4 加样回收率试验 取2.2.1中制备的CRS-SH粉末0.1 g，共6份，精密称定，置100 mL磨口具塞锥形瓶中，每份均精密加入浓度为0.02143 mg/mL的亚甲基蓝溶液20 mL，置于振荡器上，保持室温在20℃左右，振荡器转速150 r/min，震荡40 min，滤过，测定吸光度，计算得平均回收率为103.68%，RSD为1.03%。结果见表5。
公式：理论未吸附量=已知准确加入的亚甲基蓝的量-样品中吸附亚甲基蓝的量。
回收率（%）=检出量理论未吸附量×100%
2.5.5 样品吸附力的测定 取2.2.1中制备的SB，CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350的粉末，依法处理，以PBS缓冲液为空白，测定吸光度，计算出亚甲基蓝未被吸附的量，进一步计算出吸附力。结果见表6。
由表6可以得出黄芩炭比生黄芩的吸附性增加，由马弗炉烧制的黄芩炭的吸附力更大，其排列顺序为：CRS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。
2.6 止血作用与吸附力的相关性 本研究中小鼠断尾和肝脏出血时间反应的是止血作用强弱，出血时间越短，止血作用越强。从图2可以看出，在一定范围内，黄芩炭的出血时间与吸附力呈负相关，即止血作用与吸附力呈正相关，且相关系数大于0.97，相关性良好。
3 讨论
马弗炉闷煅法炮制温度的选择：本研究在马弗炉闷煅法制备黄芩炭的过程中，曾设置了较低温度200℃和较高温度400℃两个温度点，但是200℃下制备的黄芩炭炭化程度比较低，表面呈焦黄色，与炒炭的要求相差较大，属于炮制程度“不及”;而400℃下制备的黄芩炭已经出现了明显灰化，属于炮制“太过”，故在两个温度下制备的黄芩炭均没有进行止血药效实验。
止血实验：由于止血涉及多途径的相互作用，体外止血实验具有一定的片面性，故本研究选择小鼠进行体内止血实验，更能反映止血的整体效应。在止血模型的选择上，选取了断尾出血和肝脏针刺出血两个典型的出血模型[5-8]来评价黄芩炭的止血作用，结果阳性药物组与生理盐水组在出血时间上有显著差异，不同炮制方法制备的黄芩炭均表现出一定的止血作用。
以吸附力作为炭药质量控制的指标，对炭药质量标准和炮制工艺的研究重要意义。据报道，藕节炒炭后，吸附力增强，对小鼠的凝血作用增强[9];干姜炒炭后吸附力比生品增强，其止血作用也相应增强[10]。而黄芩炒炭后的吸附力变化与止血药效之间的直接关系，目前还未见报道。本研究明确了黄芩炭止血作用与吸附力之间呈正相关，并在一定程度上筛选出了马弗炉闷煅法制备黄芩炭的较优工艺条件。为将来以吸附力为评价指标优选黄芩炭的炮制工艺、提取工艺和质量控制等研究奠定了坚实的基础。
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