丹红注射液预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞损伤的影响

来源:用户上传      作者: 郑亚萍 韩坤

　　[摘要] 目的 研究丹红注射液预处理对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的作用。 方法 体外培养大鼠心肌细胞，将丹红注射液以2％、4％、8％、16％四种浓度分别加入培养基中，预处理24 h后，置于缺血再灌注（I/R）环境中培养，采用流式细胞仪技术检测各组细胞的凋亡率，免疫组织化学法检测凋亡基因Bax及Bcl-2蛋白表达变化。 结果 与正常对照组比较，缺血再灌组细胞凋亡率及Bas表达明显升高，Bcl-2表达则显著降低；而用丹红注射液预处理后呈浓度依赖性地下调凋亡率及Bas表达，上调Bcl-2表达。 结论 丹红注射液对缺血再灌心肌细胞有保护作用，且与浓度有一定的依赖关系，其作用可能是通过上调Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达实现的。
　　[关键词] 丹红注射液；缺血再灌；心肌细胞；细胞凋亡
　　[中图分类号] R331.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（a）-0024-02
　　
　　The effect of Danhong Injection pretreatment on cardiomyocytes cell of ischemic-reperfusion rats
　　ZHENG Yaping HAN Kun
　　Department of Physiology, Luohe Medical College, He′nan Province, Luohe 462002, China
　　[Abstract] Objective To investigate the effect of Danhong Injection pretreatment on cardiomyocytes cell of ischemic-reperfusion rats. Methods The rats cardiomyocytes were cultured and pretreated with Danhong Injection in four different concentrations: 2％, 4％, 8％, 16％ before create cardiomyocytes I/R model after 24 hours for pretreatment. The apoptotic rate of cardiomyocytes was determined by flow cytometry, the protein expressions of Bcl-2 and Bax were observed by imnmnohistochemistry. Results Compared with control group, the apoptotic rates were significantly increased in ischemia-reperfusion (I/R) group, and the protein expressions of Bax expressions was significantly up-regulated and Bcl-2 expressions was down-regulated. Pretreatment of cardiomyocytes with Danhong Injection increased the expression of Bcl-2, decreased the expression of Bax and the apoptotic rate in a dose-dependent fashion. Conclusion Danhong Injection alleviates I/R injury in a concentration-dependent manner. These effects may be partially that Danhong Injection can inhibit Bas gene protein expression and induce Bcl-2 gene protein expression.
　　[Key words] Danhong Injection; Ischemia-reperfusion; Cardiomyocytes; Apoptosis
　　
　　心肌缺血再灌注损伤（isehemia-reperfusioninjury，I/R）是心脏缺血性疾病及心外术后心肌损害的主要原因，其导致的心肌细胞凋亡被认为是再灌注损伤的重要环节。丹红注射液是由丹参与红花萃取制备而成，具有保护心血管的作用，已有动物实验提示丹红注射液对大鼠离体心脏缺血再灌有保护作用[1]，但其对缺血再灌心肌细胞的直接作用的报道较少。本研究采用心肌细胞缺血再灌注细胞模型，观察丹红注射液预处理对其的影响，初步研究其作用的可能机制。
　　1 仪器与试药
　　1.1 实验动物
　　出生2～3 d的SD大鼠。
　　1.2 试剂
　　丹红注射液（济南步长制药有限公司，批号：Z20026866），胰蛋白酶、DMEM培养基（均为Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司），鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体、抗Bcl-2、抗Bas（均为博士德公司），其余试剂均为市售分析纯。
　　1.3 心肌细胞培养、鉴定
　　取2～3 d的SD大鼠，在无菌条件下取出心室，剪碎，0.1%胰酶消化，收集细胞，离心，重悬，置于二氧化碳培养箱中孵育。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间不同，采用差速贴壁1.5 h，获得心肌细胞。免疫组化染色观察α-横纹肌肌动蛋白反应。
　　1.4 缺血再灌注体外模型的建立
　　将培养的心肌细胞更换无血清培养基，缺氧培养箱（95%N2、5%CO2）中培养3 h后，置10%胎牛血清DMEM培养基，常规培养9 h。
　　1.5 实验分组
　　将心肌细胞按照2×105/mL均匀的接种于24孔板中，丹红组分别以2%、4%、8%、16%的给药浓度[1]，实验共分6组，每组5个孔，即：①正常对照组（用无胎牛血清的高糖DMEM培养液）；②缺血再灌注（I/R）组；③I/R+丹红注射液（2%）组；④I/R+丹红注射液（4%）组；⑤I/R+丹红注射液（8%）组；⑥I/R+丹红注射液（16%）组。
　　1.6 流式细胞仪检测凋亡率
　　0.25%胰蛋白酶消化各组心肌细胞，用4℃预冷的PBS洗涤2次，离心5 min，重悬细胞，于70%冷乙醇（4℃）过夜。检测时离心10 min（1 000 r/min），PBS洗去乙醇。细胞沉淀用碘化丙啶（PI）4℃避光染色30 min，上机检测。G期前的亚二倍体峰即代表凋亡峰，反映凋亡细胞的百分比。
　　1.7 Bas、Bcl-2基因蛋白表达
　　各组心肌细胞爬片，固定，在室温下用3% H2O2处理30 min以灭活过氧化物酶，后加入Bcl-2、Bax抗体4℃过夜，加入冲洗后依次加入1∶100生物素化山羊抗兔IgG和1∶100抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物液，DAB染色，复染，脱水，透明后封片。细胞浆显示棕黄色颗粒细胞为阳性细胞，将玻片于光学显微镜下放大200倍，根据阳性细胞分布情况，每片选择10个视野，每视野计算Bcl-2、Bax蛋白阳性表达的细胞数，以平均计算阳性细胞数所占百分比作为Bcl-2、Bax蛋白蛋白阳性表达指数。

　　1.8 统计学方法
　　采用SPSS 11.5软件包进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 光镜下心肌细胞鉴定结果
　　心肌细胞鉴定光镜下观察，心肌细胞接种72 h可见细胞形态不规则，呈梭形，三角形或多边形，单核，有多个伪足伸出，形成细胞簇；免疫组化染色显示，α-横纹肌肌动蛋白呈阳性反应，阳性率达90％以上。
　　2.2 流式细胞仪检测结果
　　结果显示，缺血再灌组细胞凋亡率表达明显高于对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与I/R组比较，用丹红注射液预处理后呈浓度依赖性地下调凋亡率（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。
　　
　　表1 丹红注射液对心肌细胞凋亡率的影响（x±s，％）
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　 注：与正常对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与I/R组比较，#P < 0.05，##P < 0.01
　　
　　2.3 Bas、Bcl-2蛋白的表达
　　结果显示，缺血再灌组细胞Bas表达明显高于对照组，Bcl-2表达则显著低于对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；而与I/R组相比，用丹红注射液预处理后呈浓度依赖性的下调凋亡率及Bas表达，上调Bcl-2表达（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。
　　3 讨论
　　缺血心肌的早期再灌注治疗能减轻缺血损伤，使细胞凋亡下降，减小梗死面积，缺血较长时间后再灌注反而会引起再灌注损伤，造成细胞凋亡明显增加，因而心肌细胞凋亡被认为是再灌注损伤的重要环节[2]。丹红注射液目前已用于临床治疗冠心病，且对离体大鼠缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用，此作用可能与抑制心肌脂质过氧化、增强抗氧化能力及调控凋亡基因有关[3]。
　　Bcl-2、Bas基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因，Bcl-2基因可抑制许多因素引起的细胞凋亡，被称为细胞凋亡抑制基因，Bas单克隆抗体在体内与Bas结合后均能导致表达Bas的细胞发生凋亡，从而证明Bas是一种识别Bas配体，并将凋亡信息传递给细胞的细胞表面受体[4-5]。本实验结果显示，心肌缺血再灌能促进心肌细胞凋亡，且伴随着Bcl-2基因表达蛋白的明显降低和Bas基因表达蛋白的明显升高；而丹红注射液则能呈浓度依赖性地下调心肌细胞的凋亡率，并伴有Bcl-2基因表达蛋白的上调和Bas基因表达蛋白的下调。
　　大鼠心肌缺血再灌注过程中， Bcl-2蛋白表达减少而Bas蛋白表达增加，表明心肌细胞凋亡可能是一方面Bcl-2蛋白表达降低，抗凋亡能力减弱，而另一方面Bas蛋白表达增加，发挥了促凋亡能力的缘故[6]。丹红注射液则可通过上调Bcl-2蛋白表达的和下调Bas蛋白表达，发挥保护缺血再灌心肌细胞的作用，这也为临床上应用丹红治疗心肌缺血再灌注损伤提供分子调控依据。
　　[参考文献]
　　[1] 郄素会，郝哲，刘增娟，等.丹红注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].现代中西医结合杂志，2008，35（17）：5428-5430．
　　[2] Wang TD，Chen WJ，Su SS，et al． Increased cardiomyocyte apoptosis following ischemia and reperfusion in diet-induced hypercholesterolemia：relation to Bcl-2 and Bax proteins and Caspase-3 activity[J]． Lipids，2002，37（4）：385-394．
　　[3] 周晓枫．丹红注射液与硝酸甘油联用治疗不稳定心绞痛疗效观察[J]．中国医药导报，2007，4（14）：65．
　　[4] Wu XW，Teng ZY，Jiang LH，et al． Human thioredoxin exerts cardioprotective effect and attenuates reperfusion injury in rats partially via inhibiting apoptosis [J]． Chin Med J（Engl），2008，121（9）：819-826．
　　[5] 郑勇萍，王焱林，陈锋，等．大鼠心肌缺血预处理对细胞凋亡的影响[J]．中华中医学杂志，2002，26（5）：265-266．
　　[6] Mukherjee S，Lekli I，Das M，et al． Cardioprotection with Alpha-tocopheryl phosphate：Amelioration of myocardial ischemia reperfusion injury is linked with its ability to generate a survival signal through Akt activation [J]． Biochim Biophys Acta，2008，1782（9）：498-503．
　　（收稿日期：2011-10-19 本文编辑：卫 轲）

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