制备壳聚糖纳米粒的影响因素考察

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　　【摘要】本文主要以粒径为壳聚糖纳米粒的评价指标，通过对乳化交联法和离子凝聚法(Sodium Polyphosphate做交联剂)制备壳聚糖纳米粒的影响因素考察，确定摩尔分子量是影响制备壳聚糖纳米粒的关键因素.对于乳化交联法，分别考察了机械搅拌法和高压均质法这两种乳化的方法的各种影响因素。对于离子凝聚法，考察的影响因素包括加入顺序、不同规格壳聚糖、药物曲尼司特、多聚磷酸钠的浓度和用量等。结果证明乳化交联法只能制备出微米级的粒子，而离子交联法只能制备出粒子浓度特别低的纳米粒溶液。
　　【关键词】壳聚糖，纳米粒，曲尼司特，离子交联法
　　
　　1仪器与材料
　　1.1实验仪器
　　高压均质机Emulsiflex―CSAvestin
　　微米粒度仪 Zetasizer Malvern instrument Ltd.
　　BS110S型电子天平 北京赛多利斯天平公司
　　KQ-250超声仪 中国江苏昆山超声仪
　　纳米粒子测定仪 Zetasizer 3000HSaMalvern
　　1.2实验试剂及药品
　　戊二醛溶液（25%） 国药集团化学试剂有限公司
　　多聚磷酸钠（Polyphosphate Sodium，TPP）国药集团化学试剂有限公司
　　多种规格壳聚糖 Zhejiang Aoxing Biotechnology
　　曲尼司特原料药 中国药科大学制药厂
　　2实验方法和结果
　　本实验制备壳聚糖纳米粒主要采用了两种方法，一是乳化交联法[1]，另一个是离子凝聚法[2]。乳化交联法中影响壳聚糖纳米粒的主要因素有：乳化方法，搅拌方法，交联时间，交联剂的用量，壳聚糖的用量等。离子凝聚法制备壳聚糖纳米粒得主要影响因素有：壳聚糖的分子量，壳聚糖的浓度和用量，药物的浓度和用量，交联剂的浓度和用量等。
　　2.1乳化交联法中搅拌方式对制备壳聚糖纳米粒的影响[3]将100ml 浓度为2.5%（W/V）的壳聚糖（分子量330万），加入20ml2.78mg/ml的曲尼司特药物溶液（溶剂为乙醇：丙酮=1：1），再加入20ml液体石蜡，加入数滴吐温80，用高压均质机300Bar乳匀后，得到120ml的乳剂。取4份22毫升的乳液分别用20毫升水稀释，加入15.7毫升的戊二醛溶液，分别用200、600、1400转/分的机械搅拌和磁力搅拌2小时。用微米粒度仪测定粒径结果见表1。
　　Tab.1 The effect of different stirring methods on nanoparticle size
　　由表中可以看出，随着机械搅拌速度的增加粒径变大。而相同条件下采用磁力搅拌处理得到的微球的粒径分布范围变窄，大小相差不大。所以此后胶联时主要采用磁力搅拌进行处理。
　　2.2交联剂用量、交联时间、温度和初乳的浓度对制备壳聚糖纳米粒的影响
　　2.2.1高压均质法制备初乳[4]将125ml 浓度为2.5%（W/V）的壳聚糖（黏均分子量330万），加入20ml2.78mg/ml的曲尼司特的药物溶液（溶剂为乙醇：丙酮=1：1），再加入20ml液体石蜡，加入数滴吐温80，用高压均质机600Bar乳匀后，得到115ml的初乳。
　　2.2.2交联法制备微（纳）米球每次取12ml上述初乳，按照下表进行处理。即将初乳稀释，加水至C倍原体积，在温度D水浴条件下，磁力搅拌下滴加体积为B的交联剂戊二醛溶液（25%），继续搅拌A小时，之后用石油醚萃取三次，得到壳聚糖微球的混悬液，用马尔文微米粒度仪测定大小分布。结果见表2。A是交联时间，分为1、2、3小时三个水平；B是交联剂用量，是对初乳中所含2.5%壳聚糖溶液的体积的倍数，分为0.5、1.0、1.5倍三个水平；C是初乳稀释的倍数，分为4、6、8倍三个水平；D是水浴温度，分为30、40、50℃三个水平。
　　Tab.2Investigation of different influential factors in preparing nanoparticles by orthogonal test (L934)
　　从结果看出，第七和九个实验得到粒径分布范围比较集中，虽然制备的粒子没有达到纳米级别,但此后在进行对初乳进行交联处理时仍主要采用这两个方式。
　　2.3乳化交联法中压力对制备壳聚糖纳米粒的影响采用2因素2水平的星点复合设计考察高压均质时压力和壳聚糖用量两个因素对制备初乳的影响，压力（A），两水平300和800bar，壳聚糖体积（B）两水平40和120ml，考察对制备壳聚糖纳米粒的影响。固定液体石蜡的量20ml，取制备的初乳16ml，用表2中的第七种方法实验，结果见表3.
　　Tab.3Investigation the influences of pressure and chitosan amount in preparing nanoparticles by center design
　　用设计软件Design Expert6.0.10分析，最后得到结果如下：以水平代码表示的方程Response=+1.77+0.29* A-0.64* B，从结果可以看出，制备的粒子主要是微米级别，而且变化都是在同一数量级内发生，所以压力对用高压均质法制备壳聚糖纳米粒粒径影响不大。
　　2.4离子凝聚法中壳聚糖分子量、浓度和交联剂的用量对制备空白壳聚糖纳米粒的影响
　　离子凝聚法制备空白壳聚糖纳米粒的基本方法：配制浓度为1.0mg/ml和2.0mg/ml的壳聚糖溶液25ml，室温磁力搅拌下分别用恒流泵加入2.0、4.0、6.0ml 的1.0 mg/ml多聚磷酸钠溶液（Sodium Polyphosphate，TPP），加入速度为1ml/min，搅拌30分钟后停止搅拌，静置20min，用双层纱布和G-1漏斗过滤后，用纳米粒度仪测定。记录每一种壳聚糖粒子的最小粒径，结果见表4和图3。从结果看出，纳米粒分散指数较大，粒径在261nm以上。
　　Tab.4 The influences of chitosan(CS) molecular weight and sodium polyphosphate(TPP) amounts in preparingnanoparticles
　　Fig.3Particle size of blank nanoparticles prepared with different molecular weight chitosan：(A)MW=594，000, (B)MW=875，000，（C）MW=906，000（D）MW=330，000，（E）MW=400，000
　　2.5离子凝聚法载药壳聚糖纳米粒的制备将分子量分别为59.4万、87.5万、90.6万、330万和400万的壳聚糖溶解成0.5、1.0、2.0mg/ml的溶液，室温磁力搅拌下，加入药物溶液或药物与TTP的混合液，加入后即见到肉眼可见蓝色悬浮物，搅拌一定时间后，用0.8um滤膜过滤，滤液中几乎得不到纳米粒。药物浓度为1.0mg/ml，溶解药物主要使用三种溶剂：一是pH大于10.0的强碱性NaOH水溶液；二是乙醇和丙酮等份的混合溶剂；三是添加增溶剂聚乙二醇400的中性水溶液。这表明这些高分子量的壳聚糖均不能制成载曲尼司特的壳聚糖纳米粒。
　　3讨论
　　通过对乳化交联法制备壳聚糖纳米粒的各种影响因素的考察，发现高压均质法优于机械搅拌法，对制备得初乳的处理方式都是一样，说明两者之间的差异主要是制备的初乳的乳滴大小不同，这一点也已通过实验证明。高压均值法制备乳剂时，油相采用的是液体石蜡，造成清洗高压均质机时消耗大量的丙酮和和乙醇，试验成本高而且不环保。
　　离子凝聚法制备工艺简单，成本低，通过各种影响因素考察发现，壳聚糖分子量是影响粒子粒径的主要因素。制备时发现，无论何种高分子量的壳聚糖溶液，只要加入即使是浓度很低的药物溶液都会产生大的悬浮物，随着壳聚糖分子量的增大，最后过滤除掉的大的悬浮物越多，虽然从图3看来，制备的粒子达到了纳米级别，但是多分散指数太大，而且产率太低，原料和辅料浪费严重。因此下一步工作，从壳聚糖的分子量方面着手，对壳聚糖进行降解，制备低分子量的壳聚糖。
　　
　　参考文献
　　[1] 赵琳琳,韩刚，宋树美等. 姜黄素壳聚糖微球的制备及体外药物释放研究[J].中药材2007，30（2）：230-232.
　　[2] 陈浮,黄园. 尿素酶三甲基壳聚糖亚微球的制备及其相关性质的初步研究 [J].华西药学杂志2007,22(1): 012-014.
　　[3] 张艳华,魏玉辉,刘志红等. 苦参碱壳聚糖微球的制备及体外释药[J].中国医院药学杂志2006，26 （3）：307-310.
　　[4] 古永红,王连艳,谭天伟等. 尺寸均一的壳聚糖微球的制备及其作为胰岛素控释载体的研究[J].生物工程学报 2006，22（1）：150-155
　　
　　通讯作者：李飞豹
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