高效液相色谱法测定苯妥英钠血药浓度

来源:用户上传      作者: 左晶 宋新文 汪洋 许琼 刘炘

　　[摘要] 目的：建立测定血清中苯妥英钠浓度的高效液相色谱法。方法：以Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，10 μm）为色谱柱，流动相为甲醇-水（50∶50），流速为0.8 ml/min，检测波长为230 nm，血清样品加入3 μl硫酸溶液（6 M）混匀后用重蒸乙醚提取。结果：苯妥英钠血清样品线性范围为2.00～150.00 mg/L，低、中、高三种不同浓度（8.33、33.33、100.00 mg/L）加样回收率分别为98.40%、95.50%、102.71%，日内、日间RSD均小于5%。结论：本方法准确性好，灵敏度高，操作简便，可满足苯妥英钠血药浓度监测要求。
　　[关键词] 苯妥英钠；血药浓度；高效液相色谱法
　　[中图分类号] R969.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（a）-072-02
　　
　　Determination on the concentration of Phenytoin Sodium in serum by HPLC
　　ZUO Jing, SONG Xinwen, WANG Yang, XU Qiong, LIU Xin
　　Department of Pharmaceutical, the Children′s Hospital in Wuhan City, Hubei Province, Wuhan 430016, China
　　[Abstract] Objective: To establish HPLC method to determine the concentration of Phenytoin Sodium in serum. Methods: The chromatographic column was Hypersil C18 (4.6 mm×200 mm, 10 μm), the mobile phase was methanol and water (50∶50), the flow rate was 0.8 ml/min, and the detective wavelength was 230 nm. 3 μl sulphuric acid solution (6 M) was added to serum and was mixed evenly, then Phenytoin Sodium was extracted by evaporated ethylether. Results: The linear range of Phenytoin Sodium in serum was 2.00-150.00 mg/L. The recovery rates of mild, middle and high concentration (8.33, 33.33, 100.00 mg/L) were 98.40%, 95.50%, 102.71% respectively, and the within-day RSD and day to day RSD were both lower than 5%. Conclusion: The method is accurate, sensitive and simple, which can satisfy the requisition of determination of Phenytoin Sodium in serum.
　　[Key words] Phenytoin Sodium; Serum concentration; HPLC
　　苯妥英钠是临床上应用最广泛的抗癫痫药物之一，其抗癫痫效应显著而镇静作用轻微。但本药属于饱和代谢动力学药物，用量的轻微增加就可引起血药浓度的显著上升，临床应用不易掌握剂量，必须进行血药浓度监测[1]。高效液相色谱法测定苯妥英钠血药浓度已有报道[2-4]，但大多提取过程繁锁费时，色谱条件不太令人满意。为此本文建立了一种简便、快速、准确的高效液相色谱法测定苯妥英钠血药浓度，现报道如下：
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　Agilent1100高效液相色谱仪，包括G1311A-四元泵、G13222－脱气机、G1313A-柱温箱；G1314A-UV紫外检测器、HP化学工作站（美国HP公司）；WH-1微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；LDZ4-0.8A台式离心机（北京医用离心机厂）；AB204万分之一电子分析天平（瑞士产）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。
　　1.2 试药
　　苯妥英钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100210-200401）；乙醚为分析纯（上海马陆制药厂，批号：20110615，经重蒸后使用）；6 mol/L硫酸溶液（实验室自制，批号：100307）；灭菌蒸馏水（安徽双鹤药业有限公司，批号：1010234C）；甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20110509）。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱为Hypersil C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流动相为甲醇-水（50∶50）；流速为0.8 ml/min；柱温为30℃；检测波长为230 nm；进样量为20 μl。在该色谱条件下，色谱峰与血清中内源性杂质峰很好分离，无干扰峰出现，苯妥英钠的保留时间为9.5 min左右。空白血清、血清样品及苯妥英钠对照液色谱图，见图1。
　　2.2 对照品溶液的制备
　　精密称取苯妥英钠对照品16.0 mg置10 ml容量瓶中，加灭菌蒸馏水溶解并稀释至刻度，得1 600 μg/ml储备液。再按照倍比稀释原则，用灭菌蒸馏水配制浓度分别为800、400、200、100、50、25 μg/ml的系列苯妥英钠对照品溶液。
　　2.3 血清样品处理
　　量取血清0.25 ml，加入3 μl、6 mol/L硫酸溶液，混匀，再加入3 ml重蒸乙醚漩涡混合后于3 000 r/min离心2 min，吸取乙醚，如此操作2次，合并乙醚，置40℃水浴中蒸干，残渣用0.25 ml、50%甲醇复溶后，取20 μl进样测定。
　　2.4 方法学考察
　　2.4.1 标准曲线制备 取空白血清1.0 ml，依次加入苯妥英钠系列对照品溶液及储备液0.1 ml，配制成苯妥英钠浓度分别为2.27、4.54、9.09、18.18、36.36、72.72、145.45 mg/L的系列工作血清样品。取以上工作血清，按“2.3”样品处理项下的方法操作，取20 μl进样测定，记录色谱图，以样品的浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程：C=0.066 6A-0.953 3（r=0.999 0）。结果表明，苯妥英钠血药浓度在2.00～150.00 mg/L范围内线性关系良好。最低定量浓度为2.00 mg/L。
　　2.4.2 稳定性试验 取苯妥英钠对照液分别于0、8、24、48、72、96、120 h进样测定，结果色谱峰面积RSD为0.47%，表明苯妥英钠对照液在120 h（5 d）内是稳定的。
　　2.4.3 加样回收率试验 取空白血清1.0 ml，加入0.1 ml苯妥英钠对照水溶液，配制成低、中、高浓度分别为8.33、33.33、100.00 mg/L苯妥英钠血清样品各3份，按“2.3”项下样品处理的方法操作，每日取各浓度样品3份，连续测定3 d，以标准曲线方程计算样品实测浓度，与配制浓度比较，计算低、中、高各浓度加样回收率及其日内、日间精密度。见表1。
　　
　　表1 苯妥英钠血清加样回收率试验结果
　　
　　3讨论
　　3.1 检测波长的选择
　　文献[2]、[3]、[4]分别采用211、254、203 nm作为检测波长，但低波长（203、211 nm）处由于接近甲醇的截止波长，容易产生基线漂移和较大的背景吸收。采用254 nm作为检测波长，苯妥英钠的吸收度稍小，故本实验采用230 nm作为检测波长。
　　3.2 提取溶剂的选择
　　吴宏卫等[2]采用在血清中加入磷酸盐缓冲液后再用氯仿∶异丙醇（9∶1）提取，林建设等[3]直接用乙酸乙酯提取血清中苯妥英钠，张丹等[4]于血浆中加入磷酸盐缓冲液和氯化钠后再用乙酸乙酯进行提取。由于氯仿和乙酸乙酯的沸点较高（分别为61℃和77℃），采用这两种溶剂提取后均需在较高水浴温度（60℃）及氮气流下吹干，耗时较长。考虑到乙醚具有沸点低（35℃）、挥干时间短的特点，本实验采用先加入酸性物质于血清中使苯妥英钠转化为苯妥因，再用重蒸乙醚进行提取的办法。结果表明，血清中内源性杂质干扰少，提取回收率令人满意，操作简便。
　　
　　[参考文献]
　　[1] 李家泰.临床药理学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2007:1067-1068.
　　[2] 吴宏卫,蔡琳,陈仁昊.重症苯妥英钠中毒的药学监护[J].中国临床药学杂志,2006,15(6):382-384.
　　[3] 林建设,文晓莉.反相高效液相色谱法测定人血清中苯妥英钠浓度[J].中国药师,2007,10(10):1016-1017.
　　[4] 张丹,汪世英.反相高效液相色谱法同时测定血浆中苯妥英钠及其主要代谢产物的浓度[J].华西药学杂志,1995,10(1):25-28.
　　（收稿日期：2011-09-05）

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