凸尖杜鹃组培快繁体系的构建

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　　摘要：通过对凸尖杜鹃（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）實生苗的启动与增殖培养，探索适宜凸尖杜鹃的灭菌方法及其启动与增殖培养基配方，以建立凸尖杜鹃的组织培养体系。结果表明，两种杜鹃用0.1%的HgCl2灭菌8 min真菌污染率较低，在此处理下凸尖杜鹃和泡泡叶杜鹃（Rhododendron edgeworthii Hook. f.）的真菌污染率分别为5%和10%;当培养基中的吲哚丁酸（IBA）浓度为0.3 mg/L、玉米素（ZT）浓度为0.01 mg/L时，凸尖杜鹃实生苗的启动率最高，达到80%;当噻苯隆（TDZ）的浓度为    6 mg/L时，增殖倍数最高，达到5.32。
　　关键词：凸尖杜鹃（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）;组织培养;生长素;细胞分裂素
　　中图分类号：S685.21;Q943.1         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0124-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.030           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Through the initiating and proliferating culture of Rhododendron sinogrande seedling， the sterilization method and media components of initiating and proliferating culture suitable for R. sinogrande were explored to establish the tissue culture system of R. sinogrande. The results showed that， the fungus contamination rate of two kinds of Rhododendron were lower when they were sterilized for eight minutes under 0.1% HgCl2， and the fungus contamination rate for R. sinogrande and R. edgeworthii Hook. f. was 5% and 10%， respectively. The initiation rate of R. sinogrande seeding was the highest for 80%， when the concentration of IBA was 0.3 mg/L and the concentration of ZT was 0.01 mg/L in the medium; The multiple proliferation was the highest for 5.32， when the concentration of TDZ was 6 mg/L in the medium.
　　Key words： Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.; tissue culture; auxin; cytokinin
　　凸尖杜鹃（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）为常绿乔木，属杜鹃花科杜鹃花属，原产于云南西部和西北部、西藏东南部，生于海拔    2 100～3 600 m的高山杜鹃林或针叶林中。该物种花型美丽，颜色鲜艳，具有很高的观赏价值，在盆栽中的应用性也很高。但是，由于它生长于海拔较高的地方，且生长环境特殊，同时受季节和母本材料等的限制，导致目前无法进行大量的商品化生产。
　　杜鹃花属于中国十大名花之一，深受广大花卉爱好者的喜爱，但其栽培繁殖存在一定的问题。杜鹃的繁殖方式主要是种子繁殖、扦插繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖等[1]。杜鹃花科植物的多数种在扦插繁殖过程中往往难以生根，并且由于多种因素的影响，杜鹃花科植物扦插即使生根，通常也难以成活[2]。再者，播种、扦插和嫁接等方法比较容易受季节和母株材料的影响，导致杜鹃繁殖系数降低，并且生长周期长，不适宜进行大规模的商业化生产[3]。
　　运用植物组织培养技术繁育观赏植物，具有繁殖系数高、繁殖速度快、不受季节影响、易于产业化等优点[4]。因为组织培养属于无性繁殖，后代产生变异的可能性较低，同时，比起常规的扦插、嫁接、种子繁殖等方法，它的繁殖速度成倍增加，且繁殖率很高[5]。目前，国内对杜鹃花的研究主要集中在种子繁殖、扦插繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖以及植物分类学研究等方面，而对其组培快繁体系建立的研究报道较少[6]。杜鹃资源的组织培养只在少数几个种类上进行过研究[7，8]，而鲜见关于凸尖杜鹃的组织培养研究。为此，试验通过对凸尖杜鹃组织培养体系的构建，以期为其商品化生产奠定基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  研究对象  以凸尖杜鹃为研究对象，播种后，待实生苗长到1.0～1.5 cm时作为组织培养的外植体。
　　1.1.2  试剂及仪器设备
　　1）试剂。1/4 MS培养基、玉米素（ZT）、吲哚丁酸（IBA）、噻苯隆（TDZ）、NaOH溶液、0.1% HgCl2溶液、75%的乙醇、工业乙醇、无菌水。 　　2）仪器设备。超净工作台、高压灭菌锅、接种操作器具、组培光照培养室。
　　1.2  方法
　　1.2.1  播种  将凸尖杜鹃种子播种于穴盘上，定期浇水。
　　1.2.2  启动培养
　　1）灭菌方法的筛选。由于不同品种杜鹃的细菌污染率和真菌污染率存在一定差异，为了探索不同品种杜鹃的灭菌效果差异，在启动培养前先进行灭菌方法的筛选。即将凸尖杜鹃（T）与泡泡叶杜鹃（Rhododendron edgeworthii Hook. f.）（P）分别用处理1（0.1% HgCl2灭菌6 min）和处理2（0.1% HgCl2灭菌8 min）两种方法灭菌后，接种在不添加激素的1/4 MS培养基上，每处理两种杜鹃分别接种小苗30株。
　　2）培养基。基本培养基为1/4 MS培养基，pH 5.4～5.6，121 ℃高压灭菌30 min[9]。在试验所用的培养基中分别添加不同浓度的ZT和IBA，采用完全随机设计，每处理接种小苗30株。具体设计见表1。
　　3）灭菌。选择1.0～1.5 cm生长状况良好的凸尖杜鹃实生苗，用洗洁精浸泡处理10 min，然后用清水漂洗，再用流动的自来水冲洗1 h（由于小苗较脆弱，冲洗时可在烧杯上盖上一层纱布），之后再用75%的乙醇浸泡30 s，然后用无菌水冲洗3～5次。最后用0.1%的HgCl2消毒8 min，无菌水冲洗3～5次。
　　4）接种。超净工作台及操作室先紫外灯灭菌30 min，然后在操作台中将处理好的实生苗分别接种在启动培养基上。
　　5）培养条件。将接种后的小苗置于组培室中，培养温度23～28 ℃，光照度1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d。
　　1.2.3  增殖培养
　　1）培养基。1/4 MS基本培养基中添加不同浓度的TDZ和IBA，试验采用完全随机设计，每处理接种外植体30个。具体设计见表2。
　　2）接种。将启动培养后小苗的芽切下，分别接种在增殖培养基上。
　　3）培养条件。将接种后的小苗置于组培室中，培养条件与启动培养相同。
　　1.2.4  数据统计和分析
　　污染率=污染的外植体数/接种外植体数×100%
　　成活率=未污染外植体成活数/未污染外植体总数×100%
　　启动率=未污染外植体启动数/未污染外植体总数×100%
　　增殖倍数=增殖后的芽数/接种的外植体数[10]
　　运用SPSS 19.0对数据进行显著性分析，然后用LSD法进行多重比较[11]。
　　2  结果与分析
　　2.1  灭菌方法的筛选
　　灭菌处理后将杜鹃小苗接种到1/4 MS培养基上，每天观察并记录，两周后统计污染情况。从图1可以看出，灭菌时间对灭菌效果存在影响。在两种处理下，两种杜鹃的真菌污染率存在显著差异，其中0.1% HgCl2灭菌8 min的杜鹃小苗真菌污染率较低，而细菌污染率与成活率均无显著差异。综合得出，0.1% HgCl2灭菌8 min为最佳灭菌方法。
　　2.2  启动培养结果
　　将凸尖杜鹃小苗接种到启动培养基上培养，60 d后统计启动率。不同浓度的吲哚丁酸（IBA）与玉米素（ZT）的组合对凸尖小苗的启动率有一定影响，9种处理下的启动率存在明显差异，其中，最优的激素组合为A1（1/4 MS+0.3 mg/L IBA+0.01 mg/L ZT）（图2）。
　　2.3  增殖培养结果
　　将接种后的凸尖杜鹃芽苗增殖培养60 d后统计增殖倍数（图3）。由图3可以看出，噻苯隆（TDZ）的浓度对凸尖杜鹃芽的增殖有影响，在不同浓度下的增殖倍数差异明显，其中，噻苯隆（TDZ）浓度为6.0 mg/L时，增殖效果最好，增殖倍数达到了5.32。
　　3  小結与讨论
　　3.1  灭菌方法的筛选
　　凸尖杜鹃植株表面附有绒毛，给组培过程中的灭菌操作带来了困难，接种后的污染率极高。试验数据表明，用0.1%的HgCl2灭菌8 min后，组培苗的真菌污染率最小。而在其他文献中也有相关结论。例如吴福建[5]的研究中就得出过类似结论，即较长时间的次氯酸钠和短时间的HgCl2配合使用，对杜鹃的毒害较小，但污染率较高，综合考虑用0.1%的HgCl2处理茎段8 min的消毒效果最好。这与本研究得出的结论相同。但是，陈振光等[12]提出，HgCl2虽然灭菌效果好，却极易残留，并且对植物组织和细胞杀伤力较大。综合以上结论分析，虽然HgCl2对植物的毒害作用较大，但是小苗的再生能力强，因此能够快速地代谢掉灭菌后剩余的HgCl2，且小苗的茎干尚未木质化，则褐化的可能性较小，因此，凸尖杜鹃小苗的最佳灭菌方法为0.1% HgCl2灭菌8 min。
　　3.2  启动培养
　　在启动培养时，本研究选择的细胞分裂素为ZT，钟宇等[13]在研究中提出，ZT具有较强的诱导分化作用。陈幼妹[14]的研究中，采用的是改良后的1/4 MS培养基，得出在此培养基下相对较优的激素组合为1/4 MS+ZT 2 mg/L+IAA 0.5 mg/L;何芳兰[15]也在组培研究中使用了ZT与IBA的组合，得出的最佳启动组合为ZT 1 mg/L+IBA 0.05 mg/L;不仅如此，黄萍萍[16]在研究中提出诱导率、诱导系数在ZT浓度1～3 mg/L时随浓度的升高而升高，从而得出，高山杜鹃（蒙他瑰）在1/4 MS培养基上相对较理想的激素组合为ZT 2 mg/L+IAA 0.5 mg/L。而本试验得出的最佳启动培养组合为1/4 MS+ZT 0.01 mg/L+IBA 0.3 mg/L。综上结论便可解释，虽然在本试验中启动率较高，最高达80%，但是丛芽个数较少，可能的原因是试验激素组合配比适中，适宜植株诱导出芽，但是由于ZT浓度太低，从而导致单个植株的芽个数较少。 　　3.3  增殖培养
　　在进行杜鹃组培时，植物激素一般选择KT、  6-BA、ZT等，国外使用2-ip、TDZ比较多。范玉清[17]的研究认为，TDZ由于活性较强，是用来培养较顽固的尤其是木本植物的一类较合适的细胞分裂素。因此选择了噻苯隆（TDZ）作为细胞分裂素。在杜鹃的组织培养中，目前也有了相关的研究，苗永美[18]就用TDZ和IBA的组合对大树杜鹃、桃叶杜鹃的愈伤组织进行增殖，增殖率皆达到100%。苗永美[18]最后得出的增殖培养的最佳激素组合为TDZ 0.4 mg/L+IBA 0.05 mg/L，在此配方下的增殖倍数是3.25。而本试验得出的最佳增殖配方为1/4 MS+TDZ 6.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L，且随着TDZ的浓度升高，增殖倍数不断变大。当TDZ浓度达到6.0 mg/L时，增殖倍数达到5.32。在苗永美[18]的研究中，TDZ与IBA的浓度之比接近10，而本试验中TDZ与IBA的浓度之比为6，可能因此造成了结果的差异，除此之外，还有可能是因为培养基等的影响。还有相关报道指出，TDZ易产生玻璃化苗，且浓度增大，玻璃化苗发生频率上升，但在本试验中尚未出现玻璃化现象。
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　　收稿日期：2019-01-28
　　基金项目：云南省教育厅科学研究基金（2016ZDX115）;大理州环保局横向项目“苍山濒危特有植物繁育和迁地保护实施方案”;云南省教育厅资助项目（2017ZZX027）
　　作者简介：张信玲（1995-），女（彝族），云南昭通人，2014级本科生，（电话）18887223433（电子信箱）1841474587@qq.com;通信作者，孔令芳（1983-），女，讲师，硕士，主要从事园艺植物栽培育种的研究工作，（电话）13658726280（电子信箱）lfk8310@163.com。
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