光敏色素B在调控水稻苗期株高和生物量中的作用

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　　摘要：水稻光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明，phyB在调节水稻幼苗去黄化、叶角、花期以及非生物胁迫反应中具有重要作用，但是phyB对水稻苗期株高和生物量的影响仍未有报道。本研究比较了野生型和phyB突变体（phyB1和phyB2）在不同培养条件下苗期的株高、鲜重和干重，结果表明，在营养液和基质培养条件下，phyB突变体的株高均显著低于野生型，鲜重和干重与野生型差异并不明显，据此推测，phyB调控水稻苗期株高，但对生物量的影响不明显。利用基因芯片技术，比较了野生型和phyB突变体苗期地上部分的基因表达图谱，筛选到受phyB上调的基因115个，受phyB下调的基因95个;差异基因的GO富集分析结果表明，富集的基因主要参与水稻生长等生物学功能，因此推测通过调控这类基因的表达而影响苗期生长。本研究首次揭示了phyB对水稻苗期株高和生物量的影响，并进一步讨论了phyB在选育机插秧水稻品种中的潜在应用价值。
　　关键词：水稻;光敏色素B;苗期;生物量;株高
　　中图分类号：S511文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0013-06
　　光不仅为植物的光合作用提供能量，而且作为一种信号影响植物的生长发育。光敏色素（phytochrome）是植物体内的一种重要光受体，主要感受红光和远红光，在植物从种子萌发到成熟的整个生长发育过程中起到重要的调节作用[1，2]。水稻光敏色素基因家族包括3個成员：PHYA、PHYB和PHYC[3，4]。Takano等的研究表明水稻phyB通过感受红光可以调节水稻幼苗去黄化、叶角、花期以及育性等[5]。而且，phyB还影响水稻的耐寒性和耐旱性[6，7]。
　　除了对形态建成和胁迫反应的调控，水稻光敏色素也参与调控碳代谢。有报道表明，水稻phyAphyBphyC三突变体白天的糖含量，特别是新叶中的还原糖、葡萄糖、果糖和半乳糖含量显著高于野生型;黑暗条件下，水稻phyAphyBphyC三突变体中的淀粉含量高于野生型，表明光敏色素影响黑暗中淀粉的利用[8]。此外，光敏色素还影响三羧酸循环组分的含量[8，9]。在其它植物中的研究也表明，光敏色素介导的光信号与碳代谢及植物生长可塑性密切相关[10]。植物碳代谢主要包括光合作用驱动的糖类合成代谢及呼吸作用介导的糖类分解代谢。碳代谢所产生的淀粉是植物体内碳的主要储存形式，是构成植物生物量的基本组分之一[11]。据此推测光敏色素影响水稻的生物量。
　　为了解析PHYB基因对水稻苗期株高和生物量的影响，本研究比较了野生型和phyB突变体水稻在不同生长条件下的干重、鲜重和株高等特性，并利用基因芯片技术分析了phyB突变体的基因表达谱，以进一步讨论phyB突变体苗期的这种生长发育和代谢特征在水稻机插秧品种改良中的潜在应用价值。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　本试验所用水稻材料共3个，分别是日本晴（WT）及其phyB1和phyB2突变体。phyB1和phyB2突变体为日本晴经γ-射线辐射诱变获得，具体遗传背景见文献[5]。
　　1.2营养液培养条件下水稻株高、干重和鲜重的测量
　　将野生型、phyB1和phyB2突变体种子用70%乙醇表面消毒1min、5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20min后，无菌水冲洗4～5次;置于28℃诱导萌发3d，然后播种于96孔板（底部去掉），转移至Yoshida溶液中，在光照培养箱中培养，光温条件是光期14h、28℃、7900lx，暗期10h、24℃。分别在Yoshida溶液中培养10、15、20、25d时测量水稻株高，并以野生型水稻的株高为100%，计算phyB1和phyB2突变体的相对高度。每两天更换一次溶液。每个材料测量至少20株。
　　每5株作为1组测量整株鲜重，然后在105℃杀青30min，80℃烘6d至恒重。利用分析天平称量干、鲜重。
　　1.3基质培养条件下水稻株高、干重和鲜重的测量
　　将野生型、phyB1和phyB2突变体种子消毒后在28℃诱导萌发4d。挑选萌发一致的种子播种到基质（济南鲁青育苗基质）中，在济南饮马泉试验农场（36°40′N，117°00′E）的网室中培养（2017年6—7月，自然生长条件）。分别于培养10、15、20、25d时测量水稻株高，并以野生型水稻的株高为100%，计算phyB1和phyB2突变体的相对高度。每个材料测量至少30株。
　　干重和鲜重的测量如上所述。
　　1.4基因芯片分析
　　对营养基质中生长至三叶期的野生型、phyB1和phyB2突变体地上部分进行取材，利用RNeasyPlantMiniKit（QIAGEN）提取RNA，然后利用22KOligo-microarray（AgilentTechnologies，USA）进行基因芯片分析，具体方法参考文献[12]。选择在野生型和phyB突变体中表达水平差异2倍的基因作为差异表达基因，并利用AgriGOv2.0在线软件对差异基因进行GO富集分析。
　　1.5数据处理与分析
　　采用MicrosoftExcel软件进行数据统计分析与做图。
　　2结果与分析
　　2.1营养液培养条件下野生型和phyB突变体的株高、鲜重和干重
　　在营养液中生长不同时间后，野生型的株高均显著高于phyB1和phyB2突变体，且各时期phyB突变体相对于野生型的株高基本不变，均在73%～80%之间（图1）。表明，PHYB基因功能缺失导致株高降低。
　　有研究表明，光敏色素介导的光信号与碳代谢和植物生长可塑性密切相关[10]。因此，我们进一步比较了野生型和phyB突变体的干重和鲜重。在萌发后10d时，phyB突变体的鲜重显著高于野生型，干重仅phyB2差异显著;在萌发后15d和20d时，野生型和phyB突变体的鲜重和干重均无显著差异;但在萌发后25d时，phyB1和phyB2突变体苗期的鲜重和干重均显著低于野生型（图2），这可能是由于营养液培养后期材料密度太大，导致生长不正常。上述结果表明，PHYB基因功能缺失在苗期不影响水稻的生物量。 　　2.2基质培养的野生型和phyB突变体的株高、鲜重和干重
　　为了模拟大田生长情况，我们比较了野生型、phyB1和phyB2突变体在营养基质中培养不同时期的株高、鲜重和干重。在萌发后不同天数，野生型的株高均高于phyB1和phyB2突变体，但是随着发育进程，株高的差别逐渐缩小（图3）。如在营养基质中培养15d时，phyB1和phyB2突变体株高分别为野生型的75.3%和74.2%;在营养基质中培养20d时，phyB1和phyB2突变体株高分别为野生型的82.9%和82.0%;在营养基质中培养25d时，phyB1和phyB2突变体株高分别为野生型的97.3%和95.7%。
　　我们进一步比较了野生型和phyB突变体的鲜重和干重。在营养基质中生长10d时，phyB1突变体的鲜重和干重均显著高于野生型;但生长15d时，phyB1突变体的鲜重和干重均显著低于野生型;生长20d和25d时，除25d时phyB1的干重显著高于野生型外，野生型和phyB突变体的鲜重和干重无显著差异（图4）。表明，在自然光照下，PHYB基因功能缺失在苗期不影响水稻的生物量。
　　2.3phyB调控的基因表达图谱
　　上述结果表明，野生型和phyB突变体之间苗期株高存在明显差异。此外，野生型和phyB突变体叶角和叶绿素含量也显著不同[5，13]。为了揭示phyB调控水稻苗期生长发育的分子机制，我们比较了野生型和phyB突变体之间的基因表达图谱。结果显示，野生型和phyB突变体之间的差异表达基因210个，其中受phyB上调（即在WT中表达水平高于phyB突变体的2倍以上）的差异表达基因115个，受phyB下调（即在WT中表达水平低于phyB突变体的2倍以上）的差异表达基因95个。利用AgriGOv2.0在线软件对差异表达基因进行GO富集分析，结果表明，受phyB上调的差异表达基因主要参与生长（GO：0040007：growth）、外部刺激应答（GO：0009605：responsetoexternalstimulus）和蛋白磷酸化（GO：0006468：proteinphosphorylation）等生物学过程（图5）;受phyB下调的差异表达基因主要参与生长（GO：0040007：growth）、系统发育（GO：0048731：systemdevelopment）和生殖过程（GO：0022414：reproductiveprocess）等生物学功能（图6）。不管在上调基因还是下调基因中，富集的基因均与水稻生長生物学过程（GO：0040007：growth）有关，推测phyB通过调控这类基因的表达而影响水稻苗期株高。
　　3讨论与结论
　　本研究比较了野生型和phyB突变体苗期株高和生物量（干重和鲜重），结果显示，在两种培养条件下，phyB突变体的株高均显著低于野生型，这表明phyB影响水稻苗期株高。利用基因芯片筛选到受phyB上调的差异表达基因115个，受phyB下调的差异表达基因95个;差异基因GO富集分析结果表明，最富集的一类基因主要参与生长生物学过程，这可能与phyB突变体水稻株高、叶角等苗期生长发育特征有关。
　　在营养基质培养中（自然光照条件下），phyB突变体的相对株高大于营养培养条件下的相对株高。考虑到Yoshida溶液中含有水稻生长所需要的各种营养元素，我们推测，在不同培养条件下株高上的差异主要是由于光照强度或者光质导致的。PHYB编码光敏色素蛋白质，主要感受红光，因此环境中的光质必定会影响光敏色素突变体的生长发育。此外，植物体内的其他光受体如主要感受蓝光的隐花色素和向光素，以及主要感受紫外光的受体UVR8也能调节植物的生长发育。因此有一种可能性是自然光中具有更广的光谱，诱发了其他光受体的作用，弥补了phyB缺失所引起的株高损失。值得注意的是，在两种生长条件下，phyB突变体和野生型之间的鲜重和干重差异不显著，推测phyB不影响水稻苗期的生物量。
　　水稻是我国播种面积最大、总产量最多的粮食作物，是我国65%左右人口的主食，在粮食生产和消费中处于主导地位。传统水稻种植通常经过播种、育秧、插秧等多个步骤，用工多，耗时长。近几年随着农村劳动力外出务工的增多，我国水稻生产用工矛盾越来越突出。机插秧是用插秧机高效插秧代替原始手插的高产栽培技术，彻底解除了人工插秧的繁重劳动。然而机插秧对秧苗高度和秧苗质量要求很高，其中秧龄弹性是研究的核心，只有具有较大秧龄弹性范围，才能使机插水稻的推广和应用具有更强的实用性和可操作性。如果水稻品种秧苗期株高较低，可以提高秧龄弹性，有利于机插秧的推广。然而目前水稻矮化品种在整个水稻生育期都表现矮化，导致生物量和产量降低。因此需要培育在秧苗期株高较低，成株期生长势较强的水稻品种。本研究中基质生长试验基本模拟了水稻育苗阶段的生长情况，种子萌发后在基质中生长的1个月内，phyB突变体的株高低于野生型，而干重和鲜重差别不大，而且在生长后期，phyB突变体株高与野生型株高的差异逐渐缩小。phyB突变体的这种生长特征可能更适合于机插秧栽培方式。因此PHYB基因可以作为一个培育机插秧水稻品种的潜在改良位点。
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