石榴皮提取物对生猪肉饼品质的影响

来源:用户上传      作者:李颖 李保玲 董新玲 马文慧 曹云刚

　　摘 要：研究石榴皮提取物的抗氧化性能及不同质量分数（0.01%、0.05%和0.10%）石榴皮提取物的添加对生猪肉饼pH值、蒸煮损失、色差和冷藏过程中脂肪及蛋白氧化的影响。结果表明：石榴皮提取物富含多酚和黄酮，其总抗氧化能力、自由基清除能力、Fe2+螯合能力随石榴皮提取物质量分数增大而增强;石榴皮提取物的添加对生猪肉饼的pH值和蒸煮损失率无显著影响，但对生猪肉饼的亮度值、红度值有一定的负面作用;石榴皮提取物能有效抑制生猪肉饼冷藏过程中氢过氧化物、丙二醛及蛋白羰基生成，且质量分数越高抑制效果越好，整体效果优于丁基羟基茴香醚。
　　关键词：石榴皮提取物;生猪肉饼;脂肪氧化;蛋白氧化;色差
　　Abstract： The antioxidant activity of pomegranate peel extract was evaluated and the effects of its addition at different levels （0.01%， 0.05% and 0.10%） on the pH value， cooking loss， color difference and the oxidation of lipid and protein during refrigeration in raw pork patties were studied. The results showed that pomegranate peel extract was rich in polyphenols and flavonoids， and the total antioxidant capacity， free radical scavenging capacity and Fe2+ chelating capacity of pomegranate peel extract increased with the increase of its concentration. The addition of pomegranate peel extract had no significant effect on the pH value or cooking loss， but had negative effects on the brightness （L*） and redness （a*） values of raw pork patties. Pomegranate peel extract could concentration-dependently and effectively inhibit the formation of hydroperoxide， malondialdehyde and protein carbonyl during refrigeration. Overall， the effect of pomegranate peel extract was better than that of butyl hydroxy anisole.
　　Keywords： pomegranate peel extract; raw pork patties; fat oxidation; protein oxidation; color difference
　　肉及肉制品富含脂肪、蛋白质、维生素及矿物质等多种营养成分，是人类膳食的重要组成部分，深受消费者青睐[1]。但脂肪及蛋白质在肉制品加工和贮藏过程中易发生氧化，导致其颜色、嫩度、风味等品质下降[2-3]。
　　因此，有效抑制脂肪和蛋白质的氧化成为当前肉品科学及肉类企业亟待解决的问题[4]。常用的人工合成抗氧化剂（如丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、特丁基對苯二酚、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT））可能存在一定的健康隐患，且使用范围和剂量具有较大的限制性[5]，而天然植物源抗氧化剂具有安全性高、抗氧化能力强等优点，且具有抗菌、消炎、抑制心血管疾病等多种生理功效[6]。因此，天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂应用在肉制品中具有广阔的前景。
　　目前，土豆皮提取物[7]、迷迭香提取物[8]等多种植物提取物已被证实具有延缓肉制品脂肪和蛋白氧化的作用。石榴皮提取物含有大量鞣质、多酚、黄酮、生物碱等物质[9]，是非常优良的天然抗氧化剂，且具有抑制癌变、降低胆固醇水平、延缓动脉硬化等多种生理功效[10]，但目前关于石榴皮提取物在肉制品中的应用研究十分有限。因此，本研究着重探究添加不同质量分数石榴皮提取物对生猪肉饼品质及贮藏过程中脂肪和蛋白质氧化稳定性的影响，以期为石榴皮提取物在肉制品生产和加工中的应用提供理论依据和实例参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　猪后腿肉 陕西西安润家超市;石榴皮提取物（CFSLY-A-708942） 陕西嘉禾生物科技有限公司。
　　2-硫代巴比妥酸 上海科丰实业有限公司;BHA、菲啰嗪 上海瑞永生物科技有限公司;抗坏血酸、冰乙酸、石油醚、过硫酸钾 天津市科密欧化学试剂有限公司;实验所用试剂均为分析纯及以上纯度。
　　1.2 仪器与设备
　　CP213电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限
　　公司;TP-350S磁力搅拌器 杭州米欧仪器有限公司;HR/T20M冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;UV2900紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;PHS-25数显pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;PT10/30 Polytron均质机 江苏省启东市华兴乳化混合设备厂;MC-JHN30F电饼铛 广东美的集团股份有限公司。
　　1.3 方法 　　1.3.1 石榴皮提取物总酚、总黄酮含量测定
　　总酚含量测定：采用福林酚标准曲线法[11]，结果以每克石榴皮提取物中所含没食子酸质量（mg/g）表示;总黄酮含量测定：采用硝酸铝显色法[12]，结果以每克石榴皮提取物中所含芦丁质量（mg/g）表示。
　　1.3.2 石榴皮提取物抗氧化能力测定
　　测定质量浓度分别为100、500、1 000 ?g/mL石榴皮提取物的抗氧化能力，分别对应添加入肉饼中石榴皮提取物的质量分数0.01%、0.05%和0.10%（以肉饼质量为基准）。
　　总抗氧化能力测定：采用亚铁离子还原法[13]。2，2’-联氮双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2’-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）阳离子自由基清除能力测定：参照Jiang Jiang等[14]的方法。
　　1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定：参照李晓英等[15]的方法。准确吸取2 mL样品溶液于玻璃试管中，加入2 mL 60 μmol/L DPPH溶液并混合均匀，于室温下反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。
　　羟自由基清除能力测定：参照郭嘉凤等[16]的方法。准确吸取1 mL样品溶液于玻璃试管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液和8 mmol/L H2O2溶液各1 mL，混匀后在37 ℃水浴条件下反应30 min，测定510 nm波长处的吸光度，并以蒸馏水作空白对照。
　　Fe2+螯合率测定：参照蒋琰洁等[17]的方法。分别吸取1 mL 0.2 mol/L NaOH、0.1 mL质量分数0.4% FeSO4溶液、0.1 mL质量分数1%抗坏血酸溶液混合均匀，准确加入0.5 mL样品溶液，再次混匀后于37 ℃水浴条件下反应20 min，加入1.5 mL质量分数20%三氯乙酸使蛋白沉淀，在3 000×g条件下离心15 min，吸取上清液0.2 mL并加入2 mL质量分数0.1%菲啰嗪，室温下反应10 min，于510 nm波长处测定吸光度。
　　1.3.3 原料肉处理、基本指标测定及肉饼制作
　　原料肉前处理：用配有6 mm直径孔板的绞肉机绞碎原料肉，更换直径为3 mm的孔板再次绞碎，并将肉糜混合均匀。使用脂肪测定仪和水分测定仪测得肉糜脂肪含量为（6.18±0.21）%，水分含量为（75.39±1.51）%。
　　肉饼制作：将肉糜分为5 组，分别为空白、BHA、S1、S2、S3组。定义添加2% NaCl（以肉饼质量为基准）的猪肉糜为基础物质。空白组为基础物质;BHA组为基础物质中添加0.01% BHA（以肉饼脂肪含量为基准）;S1、S2、S3组分别为基础物质中添加0.01%、0.05%、0.10%石榴皮提取物（以肉饼质量为基准）。用直径为60 mm的培养皿为模具，制作质量约50 g的肉饼并用保鲜膜密封，置于冰箱4 ℃冷藏，并于当天测定其pH值和蒸煮损失率。
　　1.3.4 生肉饼pH值、蒸煮损失率测定
　　pH值测定：称取3 g左右生肉饼于50 mL塑料离心管内，加入15 mL 0.15 mol/L NaCl溶液，用均质机低速均质10 s。用pH计测定每组生肉饼pH值。
　　蒸煮损失率测定：将生肉饼称质量并计为m1，使用电饼铛Ⅱ档，预热3 min后进行煎烤，每面各煎烤2 min，待肉饼冷却至室温，用滤纸将表面汁液吸净，称质量记为m2。蒸煮损失率按下式计算。
　　1.3.5 生肉饼色差分析
　　参照曹云刚[18]的方法，于贮藏期第1、3、5、7天测定各组生肉饼的亮度值（L*）、红度值（a*）和黃度值（b*）。
　　1.3.6 生肉饼脂肪氧化情况测定
　　参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中的滴定法，于贮藏期第1、3、5、7天测定各组生肉饼的过氧化值（peroxide value，POV）。
　　参照Ahn等[19]的方法，于贮藏期第1、3、5、7天测定各组生肉饼的硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值。
　　1.3.7 生肉饼蛋白氧化情况测定
　　羰基含量测定：参照Liu Gang等[20]的方法。生肉饼肌原纤维蛋白提取：将肉糜和4 倍体积的僵直液（含10 mmol/L磷酸钠、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇双四乙酸，pH 7.0）置于组织捣碎机，低速搅拌1 min，于4 ℃、2 000×g条件下离心15 min，弃上清，所得沉淀加入4 倍体积的僵直液，重复以上步骤共3 次，所得沉淀加入4 倍体积0.1 mol/L NaCl溶液，经组织捣碎机匀浆后用纱布过滤，用0.1 mol/L HCl溶液调节pH值至6.25，2 000×g条件下离心15 min，所得沉淀即为肌原纤维蛋白。将肌原纤维蛋白溶液稀释至20 mg/mL，吸取200 μL肌原纤维蛋白溶液于1.5 mL棕色离心管中，加入0.5 mL 10 mmol/L二硝基苯肼溶液，涡旋混匀后避光反应1 h，加入0.5 mL 20 g/100 mL TCA以终止反应，在11 000×g条件下离心10 min，并用1 mL洗色液（乙醇、乙酸乙酯体积比1∶1）洗涤沉淀3 次，加入1.5 mL 6 mol/L盐酸胍，50 ℃水浴条件下反应30 min并离心（11 000×g，10 min），取上清液在280 nm波长处测定吸光度，同时以2 mol/L HCl溶液做空白对照并测定其在370 nm波长处的吸光度。 　　1.3.8 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE
　　参照李晓琳等[21]的方法。选取4 g/100 mL濃缩胶、12 g/100 mL分离胶，pH 8.3 Tris电极缓冲液，上样量为20 μL，初始电泳条件为60 V，35 min后调至120 V，至条带迁移至下边缘停止。以考马斯亮蓝R-250染色，使用脱色液脱色至清晰。
　　1.4 数据处理
　　采用Microsoft Excel、Statistix 9统计软件、Sigmaplot 12.5软件进行数据处理、显著性分析（P<0.05）及作图，结果以平均值±标准差表示。
　　2 结果与分析
　　2.1 石榴皮提取物的总酚及总黄酮含量
　　石榴皮、种子等部位富含多酚、黄酮、生物碱等活性物质[22]。本研究结果表明，石榴皮提取物的总酚含量为（93.70±9.34） mg/g，总黄酮含量为（181.96±3.44） mg/g。原田等[23]研究发现，3 个不同品种的石榴皮粉游离态多酚含量为107.55～157.60 mg/g，总黄酮含量为24.24～44.54 mg/g。不同研究测得石榴皮的总酚、总黄酮含量有一定差异，可能与石榴种类及提取方法不同有关。
　　2.2 不同质量浓度石榴皮提取物的抗氧化能力
　　由表1可知，石榴皮提取物的总抗氧化能力、ABTS阳离子自由基、DPPH自由基和羟自由基清除率及Fe2+螯合率均与其质量浓度呈正相关。当石榴皮提取物质量浓度为100 ?g/mL时，其总抗氧化能力为0.018 mmol/L;当石榴皮提取物质量浓度为500 ?g/mL时，其总抗氧化能力增强至0.528 mmol/L，约为质量浓度100 ?g/mL时的25 倍;而当石榴皮提取物质量浓度由500 ?g/mL增大至1 000 ?g/mL时，其抗氧化能力增幅相对减小，此时其总抗氧化能力为0.661 mmol/L。与本研究结果类似，时双千[24]研究发现，石榴皮粗提物多酚抗氧化能力随质量浓度升高而增强，当石榴皮粗提物质量浓度为0.13 mg/mL时，其抗氧化能力约为0.45 mmol/L，而质量浓度达到0.17 mg/mL时，其抗氧化能力可达0.60 mmol/L。
　　当石榴皮提取物质量浓度为100 ?g/mL时，其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率分别达29.22%、41.11%和86.24%;当石榴皮提取物质量浓度增大至500 ?g/mL时，3 种自由基清除率均可达到90%以上，此后随石榴皮提取物质量浓度增大，3 种自由基清除率增加幅度均不大。类似地，时双千[24]发现，石榴皮多酚的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力与其质量浓度呈正相关，且石榴皮多酚混合物的羟自由基和超氧阴离子自由基清除率与对照组VC相当，ABTS自由基清除率远高于VC。
　　当石榴皮提取物质量浓度由100 ?g/mL增大至1 000 ?g/mL时，其Fe2+螯合率由18.35%增大至40.34%，后者约为前者2 倍。与本研究结果相似，陈龙[25]研究发现，石榴皮多酚的Fe2+螯合率随质量浓度增大逐渐升高，当石榴皮多酚质量浓度由0.20 mg/mL增大至1.25 mg/mL，其Fe2+螯合率由6.55%增大至35.65%。
　　2.3 石榴皮提取物对生肉饼pH值及蒸煮损失率的影响
　　由表2可知，不同组生肉饼的pH值为5.94～5.98，蒸煮损失率为16.55%～18.36%，不同组间无显著性差异，说明石榴皮提取物的添加对生肉饼的pH值和蒸煮损失率均无显著影响。
　　2.4 石榴皮提取物对生肉饼色差的影响
　　由图1可知，空白组和BHA组生肉饼的L*明显高于添加石榴皮提取物组（S1、S2、S3），空白组和BHA组生肉饼的L*随冷藏时间延长无明显变化，而添加石榴皮提取物组生肉饼的L*随冷藏时间延长呈下降趋势，且高质量分数石榴皮提取物组下降更明显。冷藏第1天，S2、S3组生肉饼的L*分别为42.72和42.00，而冷藏至第7天时分别降低至37.35和38.44。
　　随冷藏时间延长，5 组生肉饼的a*均呈明显下降趋势，表明生肉饼新鲜度降低。空白组生肉饼的a*在冷藏期间一直降低。BHA、S1、S2、S3组生肉饼的a*在冷藏第1～5天降幅较大，分别由第1天的10.97、9.67、9.95、9.04降至第5天的4.79、4.55、5.31、3.71，此后降幅减缓。
　　空白组生肉饼b*随冷藏时间延长持续增大，这可能与脂肪氧化有关。BHA添加在一定程度上抑制了生肉饼b*升高，石榴皮提取物的添加明显抑制了生肉饼b*升高，且整体来看石榴皮提取物质量分数越高，抑制效果越明显。
　　生肉饼的颜色与肌肉组织中肌红蛋白所含铁离子的化学状态密切相关，当以二价铁离子存在时，肉呈鲜红色，当二价铁离子被氧化为三价铁离子时，肉色变暗呈褐色。石榴皮提取物具有良好的抗氧化性能，可抑制二价铁离子被氧化，但是其自身及氧化产物具有较深的颜色（棕黄色），因而本研究中石榴皮提取物对生肉饼颜色的影响是二者综合作用的结果。植物提取物对肉制品颜色的影响与其自身的色泽及抗氧化性能密切相关，如曾亮等[26]研究发现，儿茶素的添加可以有效改善鸭胸肉贮藏过程中的L和b，但对a*有一定的负面作用。
　　2.5 石榴皮提取物对生肉饼脂肪氧化的影响
　　POV和TBARs值是反映肉制品脂质氧化的2 个主要指标。虽然在冷藏条件下肉制品的生化反应大幅减缓，但是脂肪氧化导致的品质劣变仍然不可忽视。
　　由图2可知，在冷藏过程中，生肉饼的POV呈现不断增大的趋势，说明生肉饼在冷藏过程中发生脂肪氧化，生成了过氧化物。空白组和BHA组生肉饼的POV随冷藏时间延长的增大幅度明显大于添加石榴皮提取物组：冷藏期间，空白组和BHA组生肉饼的POV分别由1.79、1.00 meq/kg增大至5.82、5.02 meq/kg，S1、S2、S3组生肉饼的POV分别由0.85、0.53、0.57 meq/kg增大至2.55、2.15、2.01 meq/kg，表明添加BHA和石榴皮提取物均可以抑制脂肪氧化，但石榴皮提取物抑制氢过氧化物生成的效果比BHA更好，石榴皮提取物质量分数越高，抑制脂肪氧化的效果越好。李丽营[27]研究发现，添加苹果多酚可以抑制腊羊肉的脂肪氧化，延缓氢过氧化物的生成，高质量分数苹果多酚（0.10%、0.20%）组抑制脂肪氧化效果明显优于低质量分数苹果多酚（0.05%）组。 　　由图3可知，在冷藏过程中，空白组生肉饼的TBARs值由1.06 mg/kg增大至2.65 mg/kg，呈現明显上升趋势，BHA组生肉饼冷藏第1天的TBARs值为0.22 mg/kg，第3天增大至0.34 mg/kg，之后不再发生明显变化，S1、S2、S3组生肉饼的TBARs值在整个冷藏期间均低于0.18 mg/kg，说明本研究中石榴皮提取物的添加几乎完全抑制了生肉饼的脂肪氧化。类似地，Turgut等[2]研究发现，石榴皮提取物能显著抑制牛肉丸冷冻贮藏过程中的脂肪氧化（POV和TBARs值），0.5%、1.0%石榴皮提取物组抑制脂肪氧化的效果相近，且效果优于BHT;Jongberg等[28]研究发现，当茶多酚添加量为0.05%时，可以有效减缓香肠TBARs值的增大。
　　综上所述，石榴皮提取物能显著抑制生肉饼冷藏过程中的脂肪氧化，且石榴皮提取物质量分数越高抑制效果越好，这与石榴皮提取物的抗氧化性能（总抗氧化能力、自由基清除能力和Fe2+螯合能力）与其质量浓度呈正相关相一致。
　　2.6 石榴皮提取物对生肉饼蛋白氧化的影响
　　蛋白质氨基酸残基易于氧化生成羰基化合物，因而蛋白质羰基含量增加是评价蛋白质氧化的一项重要指标。由图4可知，空白、BHA组生肉饼冷藏第1～3天时蛋白质羰基含量剧增，分别由1.28、0.78 nmol/mg增加至2.85、2.43 nmol/mg，冷藏第4～7天蛋白质羰基含量有下降趋势。与本研究结果类似，Batifoulier等[29]发现，火鸡肉贮藏过程中其羰基含量呈先上升后下降的趋势。肉制品在贮藏后期羰基含量下降的原因可能包括：1）蛋白质氨基酸残基中的部分醛基被进一步氧化为羧基;2）醛基与相邻氨基酸的氨基作用形成共价键等[30]。S1、S2组生肉饼蛋白质羰基含量在贮藏期内缓慢增加，起始值分别为1.30、0.94 nmol/mg，最终值分别为1.72、1.18 nmol/mg;S3组生肉饼蛋白质羰基含量在整个贮藏过程中无明显变化。空白组生肉饼蛋白质羰基含量在冷藏第3天达到最高值，为同期石榴皮提取物添加组的2～3 倍。结果表明，石榴皮提取物对蛋白氧化的抑制效果远优于BHA，且石榴皮提取物质量分数越高抑制效果越好。武思敏等[31]也通过实验证实鼠尾草酸、儿茶素、绿原酸等植物多酚均具有抑制肉制品羰基生成的作用。
　　2.7 石榴皮提取物对生肉饼蛋白交联聚集的影响
　　肉制品贮藏过程中发生氧化会导致蛋白质分子通过二硫键及其他共价键发生交联聚集。不同组生肉饼在冷藏第3天的肌原纤维蛋白SDS-PAGE图谱如图5所示。
　　A.不添加二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）;B.添加DTT;MHC. 肌球蛋白重链（myosin heavy chain）。
　　由图5可知，在非还原条件下（图5A），添加石榴皮提取物组浓缩胶顶端的大分子聚合物、分离胶的MHC条带和肌动蛋白条带与空白、BHA组无明显差异，说明石榴皮提取物对生肉饼蛋白的交联聚集影响不明显。在还原条件下（图5B），各组MHC和肌动蛋白条带几乎完全恢复，浓缩胶顶端高分子聚合物条带明显减弱，说明这些高分子聚合物主要由MHC和肌动蛋白通过二硫键交联聚合形成，但仍有极少数MHC条带并未完全恢复，表明大分子聚合物中可能还存在其他共价键，如活性羰基-氨基[32]。
　　3 结 论
　　石榴皮提取物的总抗氧化能力、自由基清除能力、Fe2+螯合能力随石榴皮提取物质量浓度增大不断增强。石榴皮提取物的添加对生肉饼的pH值、蒸煮损失率无显著影响，对生肉饼的b*改善效果较好，但对L*、a*有一定的负面作用，尤其在冷藏后期负面作用更加明显。石榴皮提取物能有效抑制生肉饼冷藏过程中的脂肪氧化和蛋白氧化，其抑制效果优于阳性对照BHA组（0.01%），且石榴皮提取物质量分数越高抑制效果越好。真空包装及气调包装等条件下添加石榴皮提取物对生肉饼品质的影响仍有待进一步研究。
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