凝胶渗透色谱净化-气相色谱-质谱法检测烤鸭鸭皮中16 种多环芳烃

来源:用户上传      作者:沈习习 战俊良 汤晓艳

　　摘 要：建立北京烤鸭鸭皮中16 种多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）净化-气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测分析方法。匀浆后的烤鸭鸭皮样品经乙酸乙酯超声提取20 min，采用GPC净化，GC-MS进行检测。结果表明：16 种PAHs在1～100 μg/L质量浓度范围内线性关系良好（R2>0.996），检出限为0.08～0.39 μg/kg，定量限为0.25～1.29 μg/kg;在1、5、10 μg/kg添加水平下，16 种PAHs的回收率为66.2%～108.3%，相对标准偏差为0.7%～13.5%（n=6），满足分析要求;采用该方法对购自超市的北京烤鸭进行检测，烤鸭鸭皮样品中均未检出苯并（a）芘，苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽和?总含量也未超过欧盟限量标准（12.0 μg/kg）。
　　关键词：烤鸭;多环芳烃;凝胶渗透色谱;气相色谱-质谱联用
　　Abstract： This study established an analytical method for the determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Beijing roast duck skin by gel permeation chromatography （GPC） clean-up combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. After homogenization， samples were extracted ultrasonically with ethyl acetate， and the extract was purified by GPC before being analyzed. The results showed that the calibration curves for the 16 PAHs were all linear in the concentration range of 1–100 μg/L with correlation coefficients （R2） above 0.996， the limits of detection （LOD） ranged from 0.08 to 0.39 μg/kg， and the limits of quantification （LOQ） ranged from 0.25 to 1.29 μg/kg. At spiked levels of 1， 5， and 10 μg/L， the recoveries of the method ranged from 66.2% to 108.3%， with relative standard deviations （RSD） of 0.7% to 13.5% （n = 6）， which met the requirements for quantitative analysis. When this method was applied to Beijing roast ducks purchased from supermarkets， no benzo（a）pyrene was detected in duck skin samples， and the total content of PAH4 （benz（a）anthracene， chrysene， benzo（b）fluoranthene， benzo（a）pyrene did not exceed the EU limit （12.0 μg/kg）.
　　Keywords： roast duck; polycyclic aromatic hydrocarbons; gel permeation chromatography; gas chromatography-mass spectrometry
　　多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是广泛存在于环境及各类食品中的一类持久性有机污染物。迄今为止已发现200多种PAHs，其中食品中常见的主要有20 种左右。目前，美国环保署根据PAHs的毒性和分布等数据，将16 种PAHs优先列为污染最严重的持久性有机污染物[1]。动物实验表明，某些PAHs具有基因毒性和致癌性[2-3]，而其他不具有致癌性的PAHs也有毒性增效作用[4]。因此，众多国家和组织出台了关于PAHs的限量标准，欧盟（EU）第835/2011号条例规定，烟熏肉类和熏肉制品中，4 种PAHs（苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽和?）总量不得超过12 μg/kg，另外单独规定了苯并（a）芘的限量标准为2 μg/kg[5]。我国GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[6]在PAHs的限量指标上只以苯并（a）芘作为评价食品受PAHs污染的指标，且对肉及肉制品（熏、烧、烤肉类）中的苯并（a）芘限量为5 μg/kg。
　　肉类食品的煎烤、烟熏和油炸加工是導致其PAHs污染的主要原因[7-12]。“北京烤鸭”历史悠久，传统的北京烤鸭有挂炉烤鸭和焖炉烤鸭。挂炉烤鸭采用果木明火烤制，焖炉烤鸭是将鸭子置于植物秸杆燃烧预热好的炉腔中，采用高温焖烤[13]。北京烤鸭因其独特的烤制方式和较高的皮下脂肪含量，在高温烤制过程中油脂滴落到高温燃料上热解，易产生含有PAHs的烟雾，烟雾沉积于烤鸭表面，从而造成鸭皮中PAHs富集污染问题。 　　目前，针对烤鸭鸭皮中PAHs的检测手段主要为高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）
　　法[14-17]。廖倩等[14]采用Florisil固相萃取小柱净化方法处理烤鸭鸭皮，然后用HPLC法分析鸭皮中3 种PAHs（苯并（a）芘、二苯并（a，h）蒽、7，12-二甲基苯并蒽），方法加标回收率为73.85%～80.31%，3 种PAHs的定量限为0.56～3.19 μg/kg。石金明等[15]取绿色制造技术烤鸭的腿部和胸部鸭皮作为待测样品，利用HPLC-串联荧光检测器对鸭皮中的苯并（a）芘进行测定，结果表明，检出限为0.04 μg/kg。目前针对鸭皮基质中PAHs的测定方法灵敏度可以满足相应分析物的检测要求，但是存在待测目标物种类相对较少、部分目标物回收率偏低的问题。
　　在相应的前处理过程中，由于烤鸭鸭皮是脂肪含量较高的基质，更容易受脂溶性较强的PAHs污染，因此除脂是检测烤鸭鸭皮中PAHs的关键。常用的烤鸭鸭皮除脂前处理方法是索氏抽提-皂化法[16-17]，该方法除脂效果较好，但有研究表明，在碱性条件下PAHs可能会遭到破坏[18]，
　　且索氏提取-皂化法操作繁琐、费时费力，溶剂消耗量大。本研究针对烤鸭鸭皮基质利用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）净化，结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测的方法，开展烤鸭鸭皮中16 种PAHs的检测方法研究，为烤鸭鸭皮中PAHs污染的检测提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　烤鸭样品为从超市购买的真空包装北京烤鸭，取其中鸭胸、鸭腿部位鸭皮作为待测样品。
　　16 种PAHs标准品：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、?、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）苝、茚苯（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，h）蒽、苯并（g，h，i）苝（纯度均大于98.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;乙酸乙酯（色谱纯） 美国Fisher Scientific公司;正己烷、环己烷（均为色谱纯） 美国Honeywell公司;无水MgSO4（分析纯） 萨恩化学技术有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　GC/MS-QP2020 GC-MS仪 日本岛津公司;Accu-PrepTM MPS-GPC凝胶渗透色谱仪、Bio-Beads SX-3凝胶渗透色谱柱 美国J2 Scientific公司;N-1100D旋转蒸发仪 东京理化株式会社;Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 德国贺力氏公司;GM200研磨机 德国Retch公司;TTL-DCII氮吹儀 北京同泰联科技发展有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 标准溶液配制
　　分别准确称取16 种PAHs标准品5 mg（精确至0.01 mg），用正己烷溶解并定容至25 mL，制得200 mg/L单标储备液;然后用正己烷将16 种PAHs单标储备液混合稀释定容，配制成各PAHs质量浓度均为10 mg/L的混合标准储备液，低温避光保存。使用时用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）配制成所需标准工作液。
　　1.3.2 样品处理
　　用研磨机将鸭皮样品绞碎混匀，准确称取4 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管;加入10 mL乙酸乙酯，涡旋1 min，加1～2 g无水硫酸镁，涡旋超声提取20 min，5 000 r/min离心5 min，转移上清液至100 mL圆底烧瓶，再加入10 mL乙酸乙酯至原离心管重复提取，合并上清液于圆底烧瓶中;上清液在35 ℃水浴中110 r/min旋转蒸发浓缩至2 mL，浓缩后用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）定容至10 mL，过0.45 μm滤膜后进行GPC净化。
　　GPC净化条件：选择苯乙烯树脂SX-3凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V），流速4.7 mL/min，紫外检测波长254 nm。收集22～45 min流出液于250 mL圆底烧瓶中，于35 ℃水浴中100 r/min旋转蒸发浓缩至约2 mL，氮吹至近干，以1 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）复溶，过0.22 μm滤膜，供上机测定。
　　1.3.3 GC条件
　　参照SNT 4000—2014《出口食品中多环芳烃类污染物检测方法 气相色谱-质谱法》[19]并作相应改进。色谱柱：Agilent DB-5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;柱温程序设定：初始温度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至200 ℃，然后以8 ℃/min升至280 ℃，保持15 min;进样口温度290 ℃;进样方式为不分流进样，进样体积1 μL;载气为高纯氦气，纯度≥99.999%;恒压模式。
　　1.3.4 MS条件
　　离子源：电子轰击（electron impact，EI）离子源;EI电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;接口温度280 ℃;溶剂切割时间3 min;数据采集模式：选择离子监测模式。16 种PAHs MS测定参数如表1所示。
　　1.4 数据处理
　　每个样品平行测定3 次，实验数据用Excel软件进行处理，结果以平均值±标准差表示。
　　2 结果与分析
　　2.1 提取剂选择
　　PAHs为脂溶性化合物[20-22]，提取试剂常用乙酸乙酯、乙腈、环己烷、丙酮、二氯甲烷、苯等非极性或中等极性溶剂[23-26]。本研究针对烤鸭鸭皮脂肪含量较高的情况，选择乙酸乙酯、乙腈和乙腈-乙腈饱和正己烷（2∶1，V/V）3 种有机试剂作为提取剂。 　　由图1可知，乙腈、乙腈-乙腈饱和正己烷作为提取剂时，部分PAHs回收率较低，采用乙酸乙酯作为提取剂时，提取较充分，按本研究方法进行实验，16 种PAHs的加标回收率均在60%以上。因此選择乙酸乙酯作为提取剂。
　　2.2 提取剂用量和提取时间选择
　　研究5、10、15 mL 3 种不同提取剂用量的提取效果。结果表明，乙酸乙酯用量大于10 mL时，16 种PAHs回收率均大于60%。考虑到节约成本问题，选择乙酸乙酯提取用量为10 mL。
　　同时，研究10、20、30 min 3 种超声提取时间的提取效果。结果表明：提取时间为10 min时，约一半PAHs回收率在60%以下;提取时间为20 min时，所有目标物回收率均为60%～120%;提取时间为30 min时，大部分目标物回收率在60%以上，但有个别目标物回收率偏低。考虑到回收率和时间效率，选择超声提取时间为20 min。
　　2.3 净化条件优化
　　采用GPC对鸭皮样品提取液进行净化，根据不同相对分子质量目标物在色谱柱中保留时间不同实现对目标物的分离[27-28]。净化环节的关键是目标物收集时间段的确定。本研究通过分析鸭皮样品提取液GPC净化过程中各组分的紫外吸收谱图，并与16 种PAHs目标物混合标准液GPC净化过程中的紫外吸收谱图进行比较，最终确定GPC净化过程中PAHs目标物洗脱收集时间段为22～45 min。
　　2.4 色谱条件优化
　　由于PAHs属于非极性或弱极性化合物，因此应选择非极性或弱极性气相色谱柱[29-30]。比较Agilent DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、SHIMADZU SH-Rtx-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）和Agilent HP-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）3 种弱极性色谱柱对16 种PAHs的分离效果。结果表明，Agilent DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）对16 种PAHs分离效果较好且响应值较高，可较好地满足检测分离要求。选用Agilent DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），16 种PAHs的色谱图如图2所示。
　　1. 萘;2. 苊烯;3. 苊;4. 芴;5. 菲;6. 蒽;7. 荧蒽;8. 芘;9. 苯并（a）蒽;10. ?;11. 苯并（b）荧蒽;12. 苯并（k）荧蒽;13. 苯并（a）芘;14. 茚并（l，2，3-cd）芘;15. 二苯并（a，h）蒽;16. 苯并（g，h，i）苝。图3同。样品质量浓度50 μg/L。
　　为尽量消除基质效应对测定结果的影响，采用基质标准曲线对烤鸭鸭皮样品中的16 种PAHs进行定量分析。将一定量的16 种PAHs混合标准溶液分别加入按照1.3.2节前处理过的空白鸭皮样品中，使各目标物最终上机质量浓度为1～100 μg/L。以各化合物定量离子峰面积为纵坐标（y），以基质标准溶液质量浓度为横坐标（x）建立标准曲线，进行线性回归计算。由表2可知，16 种PAHs在1～100 μg/L质量浓度范围内线性关系良好。在优化实验条件下，分别以信噪比不小于3和10确定方法的检出限和定量限，结果表明，16 种PAHs检出限为0.08～0.39 μg/kg，定量限为0.25～1.29 μg/kg。
　　2.6 方法回收率和精密度
　　取空白鸭皮样品，分别添加1、5、10 μg/kg 3 个水平的16 种PAHs混合标准溶液，每个水平做6 个平行样，按照本方法测定回收率，外标法定量。
　　2.7 实际样品检测
　　从北京市超市购买4 种代表品牌北京烤鸭，每种品牌随机购买3 只烤鸭样品，按照已建立的方法进行提取、净化和分析。实际样品和加标样品中16 种PAHs的GC-MS典型色谱图如图3所示。
　　由表4可知，所有烤鸭鸭皮中均未检出苯并（a）芘，而品牌1、2、3样品中苯并（g，h，i）苝检出量较高，最高达34.58 μg/kg。此外，欧盟关于烟熏肉类和熏肉制品中PAHs限量标准规定的4 种PAHs（苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽和?）总量也均未超标（限量标准12 μg/kg）。
　　3 结 论
　　采用GPC净化，建立烤鸭鸭皮样品中16 种PAHs的GC-MS检测方法，结果表明，方法线性关系良好（R2>0.996），16 种PAHs的回收率为66.2%～108.3%，RSD为0.7%～13.5%（n=6），检出限为0.08～0.39 μg/kg，定量限为0.25～1.29 μg/kg。该方法净化效果好、回收率高、灵敏度好，适用于烤鸭鸭皮样品中16 种PAHs的痕量检测分析，为我国传统烤鸭加工过程中PAHs的质量监控和烤鸭产品质量安全监管提供了方法参考和技术支撑。
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