全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析

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　　摘 要 本文以扬州大学兽医学院大型仪器平台购置的全自动蛋白印迹定量分析系统—Wes为例，结合实际操作经验，从系统的工作原理、操作步骤和常见问题及原因的分析进行了总结和探索，以期为相关领域研究、技术人员了解或应用该技术提供帮助。
　　关键词 Wes;工作原理;操作步骤;常见问题及原因分析
　　中图分类号： G633.6                   文献标识码： A
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.02.061
　　蛋白质印迹法（Western Blot）是目前应用最广泛的蛋白质检测方法，该方法最初由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin于1979年提出[1]。虽然该方法不断被改进，但仍存在定量不准确、耗时长、重现性及可靠性差等问题。
　　美国ProternSimple公司于2011年推出了第一代Simple western检测平台“Simon”系统，该系统将所有实验步骤（蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析）自动化，并在3～5小时内获得结果，减少了研究人员的工作量，同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。另外，该系统可同时分析12个样品，15～150kDa的目标蛋白均可检测，结果重复性好。2014年在Simple Western基础上再次推出一系列的新产品，包括：全新的定量Western Blot仪器Wes，可以在3小时内分析多达25个样品。高通量的Sally Sue一次可检测96个样品，而Peggy Sue不仅可分析96个样品，且按照电荷或者大小自动分离蛋白，其灵敏度、准确度均明显提高。该公司2016年升级了Wes系统，在原来可检测12-440KD蛋白基础上，强化了小分子量蛋白（2～40kDa）和大分子量蛋白（200～440 kDa）等传统Western Blot难以优化检测条件的目标蛋白的检测[2]。
　　我院所购买的Wes系统即第三代Simple Western系統，下面对该技术的工作原理、操作步骤和常见问题及可能原因分析进行综述。
　　1 工作原理
　　Wes系统是基于毛细管电泳技术，通过专有的光诱导蛋白捕获技术、CCD（Charge-coupled Device）全景成像等技术实现了蛋白质检测的全自动化和定量分析。该系统摒弃了传统Western Blot制胶、转膜、抗体孵育、清洗和发光等人工操作步骤，目标蛋白的分离、捕获、固定，免疫检测和定量分析均在长为5cm、内径为100μm的微孔反应管内自动完成。微孔管内壁带有ProteinSimple专有蛋白质捕获涂层，可从40nL样品中分离、捕获、固定目标蛋白，并进行后续的超微量免疫检测反应。首先系统通过掺入每根样品管内的荧光内参校正不同微孔反应管间迁移率的差异，再通过生物素化的分子量标准品计算靶蛋白的分子量，然后靶蛋白经由免疫杂交被特异性地标记，并通过化学发光反应产生的信号被系统定量检出。
　　该系统可一次吸取并分析24个样品中的靶蛋白表达情况。用户可通过设定系统附带软件程序而自动吸取样品，依次进行电泳分离、蛋白捕获、免疫杂交和化学发光检测，而无须人工干预。运行结束后，通过软件对化学发光信号进行分析，并根据生物素化的分子量标准品给出靶蛋白的分子量。
　　2 操作步骤
　　2.1 样品的制备
　　样品的制备方法与传统Western Blot相同，所制样品保存在组织/细胞裂解液中，但不加Western Blot上样缓冲液（Loading buffer）。若裂解液中含有SDS（sodium dodecyl sulfate），样品可用ProteinSimple提供的0.1×Sample Buffer稀释;若样品裂解液中不含SDS，样品需用1×Sample Buffer稀释，最终蛋白浓度范围调整为0.2～2 μg/μL。对于丰度低的靶蛋白（如磷酸化蛋白），推荐上样终浓度为2μg/μL，其他靶蛋白可选择0.5μg/μL。样品分装后于-80℃条件下冻存备用。
　　2.2 抗体稀释
　　2.2.1 一抗
　　抗体需用ProteinSimple提供的抗体稀释液（Antibody Diluent II）稀释，稀释倍数可参考ProteinSimple及其姊妹公司R&D Systems和Novus Biologicals官网上推荐的抗体稀释度。若使用的一抗不在抗体数据库里，建议比抗体说明书推荐的Western浓度高10-20倍，即抗体说明书推荐1：1000，Wes则用1：50-1：100的稀释度。
　　2.2.2 二抗
　　目前ProteinSimple提供商品化的羊抗小鼠和羊抗兔二抗。若一抗种属来源不是小鼠和兔，需要购买相应的二抗，并用Protein Simple 提供的抗体稀释液II进行稀释。
　　2.3 Wes实验操作
　　Wes系统配备了专用的试剂盒，包括分离模块和检测模块。分离模块由不同分子量蛋白（2～40 kDa，12～230 kDa，66～440 kDa）的分离试剂盒和毛细管卡盒（25支，13支）组成;检测模块由抗兔二抗及发光液，抗小鼠二抗及发光液，无二抗仅发光液和Streptavidin HRP组成。
　　2.3.1 操作过程如下
　　1）选择合适加样板子并在第一行的第一个孔加5μL的Marker，其余孔加3μL的待测样品。
　　2）第二行加入10μL的封闭液。
　　3）第三行的第一个孔加10μL的抗体稀释液II，其余孔加入10μL稀释后的一抗。 　　4）第四行的第一个孔加10μL的Streptavidin-HRP，其余孔加入10μL稀释后的二抗 （自备二抗）。
　　5）第五行加入15μL发光液，其余实验所需试剂（洗液、分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液等）均已在加样板子中预装。
　　6） 盖上盖子，配平后在室温条件下2500rpm离心5分钟。将加样板子与毛细管一起放入仪器并启动系统。
　　7）3 h后读取数据。
　　2.4 数据读取
　　Wes系统利用Compass软件进行数据采集并获得目标蛋白的分子量、峰面积、峰面积百分比、信噪比等定量结果，最终以成像图、峰形图或模拟条带图的方式呈现。成像图是目标蛋白或荧光内参在毛细管内成像的原始图像;峰形图是目标蛋白或荧光内参的毛细管电泳图像;模拟条带图是目标蛋白或荧光内参的模拟泳道和条带图像，与传统Western Blot结果表现形式类似，但这是通过峰形图的峰面积转化成灰度值显示出来，比传统Western Blot结果更为准确。
　　该软件可调整模拟条带图的对比度，获得较传统Western Blot更为美观的图像。另外，可以对不同泳道进行选择性分析，即可以实现对同一样品不同抗体或者同一抗体不同样品的数据进行比较。
　　3 常见问题及可能原因分析
　　3.1 荧光内参相关问题
　　1） 三个荧光内参全部弥散。Wes加样板子使用前需置于室温至少24h，4℃条件会造成板内试剂成分沉淀析出而影响效果。
　　2） 荧光内参分离谱图与预期不符。此种情况一般不会出现，若出现可检查所用的试剂盒是否正确。
　　3） 荧光内参跑到毛细管外。可能是加样板子在上机前没有离心，或板子中存在气泡。故板子使用前必须室温离心，以确保每个孔内没有气泡;可采用反相吸液法加样，即移液枪推至第二档吸液而推至第一档加样，这样可留少量液体在枪头中，避免加样时产生气泡。
　　3.2 化學信号相关问题
　　1） 化学发光信号与目标蛋白含量无线性关系。可能样品浓度超出检测范围，可将样品进行多个梯度稀释，以确定目标蛋白的检测上限或下限;或优化抗体浓度。
　　2） 化学发光信号重复性差。可能抗体稀释度不合适，建议对没有推荐抗体稀释度的目标蛋白进行抗体稀释度的筛选，最佳的抗体浓度方可得到最佳的结果图。
　　3.3 成像图相关问题
　　1）成像图中出现有被亮区包围的暗区，同时峰形图中出现低于基线的负峰。可能为曝光时间过长或目标蛋白浓度过高引起的化学发光底物消耗过快而导致的信号猝灭现象。化学发光信号需要在有效的时间内进行测定。通常特定的峰值信号在前几次曝光时最高，可通过查看不同曝光时间下的数据以确定最佳曝光时间;目标蛋白浓度过高的样品，需对样品进行稀释。
　　2）成像图中因整根毛细管呈现亮区而无法识别并定量目标蛋白。可通过降低样品浓度，抗体浓度或减少抗体孵育时间，降低背景亮度;或者通过设置合适的对照来查找出现亮背景的原因，如用抗体稀释液代替一抗来设置无一抗对照，排除一抗的影响;用裂解液代替蛋白裂解物，排除样品质量影响等。对一抗进行纯化或者离心也可能会有助于降低背景。
　　4 结语
　　传统Western Blot步骤烦琐，其结果的准确性和重复性较难保证，且难以优化大分子量和小分子量目标蛋白的检测条件。Wes仅需将样品及相关试剂加入加样板内，然后将加样板和毛细管放入仪器内并启动仪器即可，检测时间缩短至3 h，每天可检测75个样品，大大提高了实验效率;另外，Wes具有检测目标蛋白分子量范围广（2～440kDa）、灵敏度高（0.2～2 μg/μL）、上样量少（3μL）、抗体使用量少（真正使用量40 nL）的优点，特别适合大分子量和小分子量目标蛋白及珍贵样品的检测。因此，全自动蛋白印迹定量分析系统将成为生命科学领域研究人员的好帮手。此技术平台2011年才推出，但已获得国内外众多用户的认可，大量应用于蛋白质组学、疾病医学以及临床诊断等各领域，相信随着时间的推移，它的使用会日趋广泛。
　　参考文献
　　[1]H Towbin，T Staehelin，J Gordon. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets： procedure and some applications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（9）：4350-4354.
　　[2]Protein Simple？.“The Simple Western Overview？”. Protein Simple？2011–2014.www.proteinsimple.com.
　　[3]Nguyen U，Squaglia N， Boge A， et al. The Simple Western？： a gel-free， blot-free， hands-free Western blotting reinvention[J].Nature Methods， 2011（8）： v-vi.
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