宜昌白山羊超数排卵效果的研究

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　　摘要：以宜昌白山羊为研究对象，探索了促卵泡素（FSH）不同剂量的超排效果。结果表明，CIDR+FSH+PG法处理宜昌白山羊，同期发情率100%，随着FSH剂量的增加，超排处理的宜昌白山羊黄体、回收胚胎和可用胚的数量增多。当FSH注射剂量为18 AU/只时，6月龄宜昌白山羊平均排卵点为18.60个、回收胚胎15.60枚，其中可用胚14.20枚;12月龄羊平均排卵点为20.00个、回收胚胎16.25枚，其中可用胚14.00枚。因此宜昌白山羊超排处理的适宜FSH剂量为18 AU/只。FSH剂量为18 AU/只时，6月龄羊的超排效果与12月龄羊之间没有明显差异，说明宜昌白山羊性成熟即可进行超排处理，该研究结果可为同期发情、超数排卵在宜昌白山羊产业化中的应用提供参考依据。
　　关键词：同期发情;超数排卵;FSH剂量;年龄;宜昌白山羊
　　中图分类号：S826         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）01-0110-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.024           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Yichang white goats were selected to study the effects of different FSH dosages on superovulation. The results showed that the rate of synchronization estrus was 100% and the number of corpus luteum， collected embryo and effectiveembryo increased with the increment of FSH dosage. When injected 18 AU FSH per goat， the corpus luteum， collected embryos and effective embryos of 6-month-old goats was 18.60， 15.60 and 14.20， respectively while of the 12-month-old goats was 20.00， 16.25 and 14.00， respectively. And the superovulation effects had no significant difference between 6-month- and 12-month- goats. It suggested that the Yichang white goat could be treated superovulation at 6-month-old and the suitable FSH dosage of superovulation for 6- and 12-months old goat was 18 AU/head.
　　Key words： synchronization estrus; superovulation; FSH dosage; age; Yichang white goat
　　宜昌白山羊是中国优良的地方山羊品种资源，具有皮薄、肉嫩、适应性强、耐粗饲等特点，先后被列入《湖北省家畜家禽品种志》《中国羊品种志》和《中国畜禽遗传资源志  羊志》。宜昌市先后引入波尔山羊等进行杂交肉羊生产，因此存在品种质量退化、数量减少等对品种资源不利的影响[1]。超数排卵是上世纪发展起来的一项繁殖新技术，即用各种外源性促性腺激素诱发动物卵巢的多个卵泡发育并排出具有受精能力卵子，是胚胎移植的重要技术环节。对宜昌白山羊超数排卵的系统研究鲜见报道，因此本试验对同期发情、超数排卵等胚胎移植关键技术在宜昌白山羊中的应用进行了研究，主要分析促卵泡素（FSH）剂量对超数排卵的影响， 以期建立一套适合于宜昌白山羊产业化生产的同期发情和超数排卵方案，为进行规模化胚胎移植提供足够可用的胚胎，也可为宜昌白山羊繁殖生产、品种保存、良種扩繁等提供技术支撑和保障。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验药品
　　山羊孕酮阴道栓（CIDR）由新西兰DEC国际有限公司生产（每个含1.9 g孕酮），促卵泡素（FSH）为日本进口产品，促排3号（LHRH-A3）来自宁波市三生药业有限公司，氯前列烯醇（PG）为上海市计划生育科学研究所生产，维生素ADE注射液为北京立时达药业有限公司生产。
　　1.2  试验羊的选择和饲养管理
　　选择13只6月龄和14只12月龄健康的宜昌白山羊为试验对象。试验羊体质健康、无繁殖障碍，健康无病，膘情中等以上，体格大小相近，发情周期正常，无明显生殖道疾病。所选山羊在试验前1个月集中进行体内外驱虫和常规免疫，采用舍饲方式饲养，根据营养需要配制日粮，按每只0.2～0.3 kg/d早晚补饲。
　　1.3  试验方法
　　将6月龄和12月龄宜昌白山羊随机分为3组，注射FSH的剂量分别为13、16、18 AU/只，进行超数排卵处理，选择16只2～3岁成年健康的宜昌白山羊公羊配种。参照羊胚胎移植技术规程（NY/T 1571—2007）采用孕酮阴道栓和前列腺素对宜昌白山羊进行同期发情处理，用FSH和促黄体素对试验母羊进行超排处理。即母羊阴道放入CIDR， 放入当天记为第0天，从第九天下午开始采用递减法在4 d内分7～8次分别注射FSH 13、16、18 AU/只，第一次注射FSH时肌注维生素ADE注射液3 mL。第十一天下午注射PG 0.2 mg。第十二天下午撤栓并用公羊试情，发情母羊不再注射FSH，改注促排3号15 μg，未发情羊继续注射FSH。第十三天继续试情，发情母羊不再注射FSH，改注促排3号15 μg，未发情羊继续注射最后1针FSH。 　　用公羊试情法鉴定母羊发情。将戴有试情布的公羊放置母羊圈，从第十二天下午开始每天早、晚各试情1次，有发情征兆并接受试情公羊爬跨的判定为发情母羊，撤栓后72 h内发情视为同期发情处理有效。发情后8～12 h采用本交配种并注射维生素ADE注射液3 mL，配种2～3次，配种间隔8～12 h。与配公羊外貌符合品种特征，精神旺盛，体质健壮，外生殖器官健康。
　　在放栓之日起第十九天禁食禁水，第二十天用手术法回收胚胎，方法参照文献[2]进行。发情母羊空腹24 h，经麻醉处理后保定于手术架，对创口刮毛和灭菌，在乳腺根部两乳静脉之间切开腹中线，将子宫及卵巢拉出体外， 记录处理羊卵巢上的黄体数。冲卵管一端在输卵管伞部插入，另一端接集卵平皿，然后将套管针经宫管连接部刺入，注射冲胚液冲胚。按ELDSEN等的分级标准，在显微镜下鉴定胚胎发育时期及胚胎状态，根据形态特征将胚胎分为A、B、C、D等级[3]，其中A、B级胚胎为合格胚，可用于移植或冷冻。记录胚胎数量、合格胚（桑椹胚和囊胚）数、退化胚数和未受精卵的数量。
　　2  结果与分析
　　2.1  宜昌白山羊的同期发情效果
　　本试验采用孕酮阴道栓和前列腺素进行同期发情处理，结果表明，6月龄和12月龄宜昌白山羊母羊经同期发情处理可在撤栓后72 h内发情，发情集中在撤栓后48 h内，发情率为100%，说明CIDR+FSH+PG处理宜昌白山羊可较好地实现同期发情。
　　2.2  FSH不同剂量对6月龄宜昌白山羊超数排卵效果的影响
　　不同剂量FSH对6月龄宜昌白山羊的超排效果的影响见表1。由表1可见，用13 AU/只的FSH处理3只6月龄宜昌白山羊，获33个排卵点，胚胎回收率66.7%，其中1只羊仅获3个排卵点且未获受精卵、1只羊获11个排卵点且只获2枚可用胚，仅1只羊获18枚可用胚。用16 AU/只的FSH处理5只6月龄宜昌白山羊，获50个排卵点，胚胎回收率90%，其中有2只羊共获3个排卵点且没有回收到胚胎、1只羊获8个排卵点并回收6枚胚胎、另2只羊获得39个排卵点和37枚可用胚胎。用18 AU/只的FSH处理5只6月龄宜昌白山羊，获93个排卵点，胚胎回收率83.9%，其中1只羊获16个排卵点和8枚可用胚胎，其余4只羊分别可回收11～24枚可用胚。从FSH不同剂量对6月龄宜昌白山羊的超排效果来看，随着FSH用量的增加，6月龄宜昌白山羊超排的回收胚胎和可用胚胎的数量逐渐增加，超排效果越来越好，其中18 AU/只的FSH剂量组超排效果最好。
　　2.3  FSH不同剂量对12月龄宜昌白山羊超数排卵效果的影响
　　不同剂量FSH对12月龄宜昌白山羊的超排效果的影响见表1。由表1可见，用13 AU/只的FSH处理5只12月龄宜昌白山羊，获65个排卵点，胚胎回收率83.1%，其中1只羊获9个排卵点但未回收到胚胎，1只羊获9个排卵点且只获1枚可用胚，另外3只羊共获47个排卵点和35枚可用胚。用16 AU/只的FSH处理5只12月龄宜昌白山羊，获78个排卵点，胚胎回收率83.3%，每只羊获8～25个排卵点和6～17枚可用胚。用18 AU/只的FSH处理4只12月龄宜昌白山羊，获80个排卵点，胚胎回收率81.3%，有9枚退化胚胎，其中有1只羊有12个排卵点但未回收到胚胎，其余3只羊每只回收到17～21枚可用胚。从FSH不同剂量对12月龄宜昌白山羊的超排效果来看，随着FSH剂量的增加，12月龄宜昌白山羊超排的回收胚胎和可用胚的数量逐渐增加，其中18 AU/只的FSH剂量组和16 AU/只的FSH剂量组超排效果相当，但18 AU/只剂量组退化胚胎数多，因此控制好发情和收集胚胎时间，用18 AU/只的FSH剂量超排效果最佳。
　　2.4  年龄对宜昌白山羊超数排卵效果的影响
　　用各剂量FSH处理6月龄和12月龄宜昌白山羊的超排效果见表2。由表2可见，当FSH剂量为13 AU/只和16 AU/只时，12月龄羊获得的黄体、回收胚、可用胚和A级胚的数量都远高于6月龄羊。而当FSH剂量为18 AU/只时，12月龄羊的超排效果与6月龄羊差异不明显，其中A级胚数量12月龄羊还低于6月龄羊。
　　3  小结与讨论
　　3.1  宜昌白山羊的同期发情
　　同期发情是指利用生殖激素制剂人为地控制并调整空怀母畜的发情周期，對母羊的发情周期进行同期化处理，从而使母羊群在短时间内集中发情和排卵，现已广泛应用于舍饲养羊生产[4]。在规模化集约化羊场使用此项技术有利于母羊发情、配种、妊娠、分娩、羔羊培育、育肥和出栏等同期化，节省大量人力和时间，降低饲养管理成本，也便于人工授精技术的实施与广泛应用，充分有效地发挥优良种公畜的作用，还可以有效缩短母畜的空怀期，节省饲料成本，增加产羔收入，提高养羊经济效益[5]。羊胚胎移植供受体的同期发情处理效果直接影响胚胎移植利用率和受胎率[6]，因此同期发情技术也是家畜胚胎移植技术中的一个重要配套技术环节，对提高优良家畜繁殖率具有重要意义。同期发情的处理方法有孕酮阴道栓法（CIDR）、前列腺素法（PG）、促性腺激素（FSH或PMSG）法及其组合法。前列腺素法可溶解黄体，促进母羊黄体退化，使母羊卵巢中的卵泡同时发育，促进母羊在预定时间内发情[7];阴道栓中孕酮的持续释放，在母羊体内形成人工黄体期与自然黄体期并存的状态，通过选择撤栓时间，促使母羊同期发情;促性腺激素则促进卵泡发育、成熟和排卵。单一激素处理山羊的同期发情效果不稳定，因此人们采用激素组合法，其中CIDR+FSH+PG法的同期发情率、排卵率、受胎率都优于CIDR+PMSG+PG法[8-10]。在自然条件下，宜昌白山羊四季发情，但春季和秋季发情较多[1]，若常年配种，一年四季连续产羔，不利于进行规模化生产和管理。而目前由于养羊业的快速发展，宜昌白山羊的养殖模式也逐渐转变为更便于管理、效率更高的舍饲养殖，同期发情作为高效养殖的技术手段在宜昌白山羊中还鲜见相关使用报道。本试验采用CIDR+FSH+PG法对宜昌白山羊进行同期发情处理，6月龄和12月龄母羊的发情率均为100%，说明此法适用于对宜昌白山羊进行同期发情处理。本试验同期发情措施也为超排与胚胎移植等先进繁殖技术在宜昌白山羊的本品种选育与提纯改良中的应用提供了技术支持。 　　3.2  宜昌白山羊的超数排卵
　　超数排卵（简称超排）是在母畜发情周期的适当时期注射外源性的促性腺激素，提高血液中促性腺激素的浓度，减少卵巢中闭锁卵泡数量，从而使较多的卵泡发育并排卵[11]。超数排卵和同期发情是胚胎移植等胚胎生物技术的核心技术环节。在家畜胚胎移植技术中，超数排卵在单胎或双胎动物胚胎移植中具有十分重要的作用，可以让优良母畜排出比正常多几倍甚至几十倍的卵子，从而最大限度地利用其优良品质[12]。超数排卵所用激素主要有FSH、PMSG和促排卵素，前列腺素和孕激素是超排的辅助激素。PMSG激素的效果比较平缓，卵巢体积不会剧烈增大，处理后的卵巢容易恢复正常，排卵效率高，排卵比较整齐。但其半衰期较长，容易引发卵巢囊肿和大卵泡的存在，从而引起供体体内雌激素水平增高，进而对卵子成熟、受精和胚胎的发育产生不利影响，导致回收胚胎的质量下降。在排卵率、受精率和高质量胚胎产量方面，FSH的超排效果比PMSG好[13]，因此FSH是目前牛、羊超排中最常用的促性腺激素。影响山羊超排效果的因素很多，如品种、年龄、季节、个体差异、激素种类、产地、剂量、重复超排等[14]。宜昌白山羊性成熟早，在正常饲养管理条件下，公、母羊3月龄就有性表现，母羊5月龄左右性成熟，初配年龄为6～8月龄[1]。本试验用不同剂量FSH对6月龄和12月龄宜昌白山羊进行超数排卵处理，比较分析超排效果，确定适合宜昌白山羊有效的超数排卵方法，为进行规模化胚胎移植提供足够可用的胚胎。结果表明，用低剂量FSH处理两个年龄段宜昌白山羊都存在回收不到胚胎的情况，剂量越大则排卵点越多且所获可用胚越多，该结果表明FSH的剂量影响山羊的超排效果。不同品种个体对FSH的应答反应不同，有其最合适的FSH剂量[15，16]，本研究发现对宜昌白山羊进行超排的适宜FSH剂量为18 AU/只。超排是一个复杂的生理过程，受多种因素影响，年龄显著影响超排效果[13]。本试验发现，当FSH剂量为18 AU/只时，6月龄羊的超排效果与12月龄羊之间没有差异，说明宜昌白山羊性成熟即可进行超排处理。本试验还发现超排处理后有的个体有大量排卵点但却没有回收到胚胎，如12月龄羊按18 AU/只的FSH剂量处理时，有1只羊有12个黄体但未回收到胚胎，其余个体都可回收20枚以上胚胎。FSH剂量越低则越易出现回收不到胚胎现象，说明宜昌白山羊个体间对激素的应答反应时间有差异，今后应在注射促排卵激素时间点上进行调整，以便获得更多的回收胚胎。
　　超数排卵技术广泛应用于山羊品种保存、良种扩繁和胚胎移植，超排处理酉州乌羊[14]、崇明白山羊[15]、陇东黑山羊[16]、阿尔巴斯白绒山羊[17]、波尔山羊[18]、重庆板角山羊[19]、红骨山羊[20]、徐淮山羊[21]获黄体12.60～23.50个、回收胚胎7.18～15.57枚、可用胚6.32～13.95枚。本试验用18 AU/只的FSH剂量超排处理宜昌白山羊，6月龄羊和12月龄羊的超排效果无明显差异，平均黄体数19.22个、回收胚胎15.89枚、可用胚数14.10枚，这些指标都高于其他山羊品种的超排处理，说明本试验采用CIDR+FSH+PG的超排处理方案适合宜昌白山羊。
　　4  结论
　　用CIDR+FSH+PG处理宜昌白山羊，同期发情率100%，超排处理的最佳FSH剂量为18 AU/只，且性成熟即可进行超排处理，研究结果可为同期发情、超数排卵在宜昌白山羊产业化中的应用提供参考。
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