广金钱草多酚的提取工艺及其抗氧化能力的研究

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　　摘    要：为研究广金钱草多酚的提取条件及其抗氧化能力，通过单因素试验和正交试验研究提取溶剂、乙醇体积分数、料液比、时间、温度、提取次数对广金钱草多酚提取的影响。结果表明，最佳提取条件为：40%乙醇，料液比（g·mL-1）1∶40，在40 ℃浸提40 min，多酚得率为（5.20±0.11） mg·g-1。广金钱草多酚对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基及亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50分别为（1.94±0.02），（40.48±0.48），（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基及亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50分别为（6.17±0.03），（136.0±1.9），（188.6±7.3） μg·mL-1，表明广金钱草多酚抗氧化能力强于Vc。
　　关键词：广金钱草;多酚;提取工艺;抗氧化能力
　　中图分类号： R284.2       文献标识码： A       DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.001
　　Extraction Technology and Antioxidant Capacity of Polyphenols from Desmodium styracifolium （Osbeck） Merr.
　　ZHANG Subin， CHEN Shulan， YU Bingbing
　　（School of Food and Pharmaceutical Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061， China）
　　Abstract： In order to study extraction technology and antioxidant capacity of polyphenols from Desmodium styracifolium， the factors such as extraction solvent， ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction time， temperature and extraction times were investigated by single factor and orthogonal test. Results showed that the maximum extraction rate of polyphenols was （5.20±0.11） mg·g-1， which was obtained by 40% aqueous ethanol with solid-liquid ratio at （g·mL-1）1∶40， 40 ℃ and 40 min. Ability to scavenge free radicals such as DPPH·， O2-· and NO2- of polyphenols extracted from Desmodium styracifolium were determined as （1.94±0.02）， （40.48±0.48）， （134.0±7.6） μg·mL-1 respectively， and which of Vc were determined as （6.17±0.03）， （136.0±1.9）， （188.6±7.3） μg·mL-1 respectively. Results indicated that polyphenols extracted from Desmodium styracifolium. styracifolium exhibited higher antioxidant capacity than Vc.
　　Key words： Desmodium styracifolium; polyphenols; extraction; antioxidant capacity
　　廣金钱草（Desmodium styracifolium （Osbeck） Merr.）为豆科、山蚂蝗属植物，别名马蹄香、铜钱草、假花生等[1]，主产于广东、广西、湖南等地，有利湿退黄、利尿通淋的作用，常用于治疗尿路结石、尿路感染、黄疸肝炎等病症[2-3]。它主要含有黄酮、酚类、生物碱、萜类以及多糖等成分[3]。对广金钱草的文献检索发现，相关研究主要集中在药理[4]和成分[5]等方面。从广金钱草中鉴别出含有vicenin-1、夏佛塔苷和vicenin-3[6]、香橙素[7]等黄酮类，香草酸、阿魏酸等酚酸类[7-8];对其活性成分的研究主要是对黄酮类的研究，也多为黄酮类的提取纯化[9-10]，至目前仍未见有对广金钱草多酚提取及抗氧化能力方面的文献研究。多酚由于其独特的多元酚羟基结构，具有抗氧化、抗肿瘤和抑菌等功效，亦可作为抗氧化剂应用于食品、医药和化妆品等领域[11]。
　　近年来对植物多酚的研究不断深入[12-13]。本研究通过单因素和正交试验研究了广金钱草多酚的提取条件，通过测定广金钱草多酚清除DPPH·自由基、超氧阴离子自由基和亚硝酸根离子的能力，以Vc为对照，评价广金钱草多酚的抗氧化能力。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与仪器
　　广金钱草干品，购于肇庆市桥东市场。
　　乙醇、抗坏血酸、酒石酸钾钠（AR），广州化学试剂厂;没食子酸（AR），天津市光复精细化工研究所;硫酸亚铁（AR），国药集团化学试剂有限公司。2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH）， Sigma-Aldrich。 　　酒石酸亚铁溶液：准确称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0.1 g和酒石酸钾钠（KNaC4H4O·4H2O）0.5 g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，备用。
　　754型紫外可见光分光光度计，上海菁华科技有限公司;HH-6数显恒温水浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂;AUY120型电子分析天平，日本岛津公司;PHS-25（数显）pH计，上海精密科学仪器有限公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 标准曲线的绘制 准确吸取0.05 mg·mL-1没食子酸的标准液 0，1，2，3，4，5 mL，分别置于刻度试管中，加2 mL酒石酸亚铁溶液，2 mL pH值7.5的磷酸缓冲溶液，加水至10 mL，放置10 min，用1 cm比色皿，以空白试剂做参比，在540 nm处测定吸光值A。以A为纵坐标，质量浓度c（mg·mL-1）为横坐标作图，得线性回归方程。
　　1.2.2 广金钱草多酚的提取方法与多酚含量的测定  取广金钱草样品，除去杂质，粉碎，过30目筛，密封备用。测得其水分含量为5.69%。
　　对提取溶剂（水、50%甲醇、50%乙醇）、乙醇体积分数（20%，30%，40%，50%，60%，70%）、料液比（g·mL-1）（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60）、提取时间（20，40，60，80，100 min）、提取温度（30，40，50，60，
　　70，80 ℃）以及提取次数（1，2，3次）这几个因素进行单因素试验。根据单因素试验的结果，选择乙醇体积分数、料液比、温度和时间为广金钱草多酚的4个影响因素，每个因素设3个水平，采用L9（34）正交表进行试验。
　　称取广金钱草样品1 g，放入锥形瓶中，按上述单因素及正交试验设定的条件加入提取剂，放入水浴锅中，恒温提取一定时间，取出冷却，过滤，洗涤残渣，滤液合并定容至50 mL。吸取提取液适量按“1.2.1”的方法测定，计算多酚得率：
　　多酚得率（mg·g-1）= c×V×n/m
　　式中：c为样液多酚的质量浓度，mg·mL-1;V为提取液体积，mL;n为稀释倍数;m为样品质量，g。
　　1.2.3 广金钱草多酚对DPPH·自由基清除能力的测定 按最佳条件提取广金钱草多酚，适当浓缩，所得样液用于进行抗氧化试验。参照参考文献[14]的方法稍作修改，将1.27×10-4 moL·L-1 DPPH·的无水乙醇溶液2 mL和样液2 mL混匀，室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度。同时测定Vc清除DPPH·自由基的能力。清除率按下式计算：
　　清除率（%）=[1-]×100
　　式中：A1为样液与DPPH·溶液的吸光度;A2为样液的吸光度;A3为DPPH·溶液的吸光度。
　　1.2.4 广金钱草多酚对超氧阴离子自由基清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法，参照参考文献[15]的方法，取2 mL样液进行清除超氧阴离子自由基的试验，测定反应体系在324 nm处的吸光度。同时对Vc进行清除超氧阴离子自由基的试验。清除率按下式计算：
　　清除率（%）=[1-]
　　式中：A1为样液与邻苯三酚的吸光度;A2为样液的吸光度;A3为邻苯三酚的吸光度。
　　1.2.5 广金钱草多酚对亚硝酸根离子清除能力的测定 采用盐酸萘乙二胺法，参照参考文献[16]的方法，并稍加改进。取5 mL样液于10 mL刻度试管中，加入1.5 μg·mL-1 NaNO2标准溶液3.0 mL，放置15 min，然后加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀，放置5 min，加入0.2%盐酸萘乙二胺0.5 mL，加水至刻度，放置15 min，以试剂空白为参比，在538 nm处测定吸光值。同时测定Vc清除亚硝酸根离子的能力。清除率按下式计算：
　　清除率（%）=×100
　　式中：A1为不加样液空白对照的吸光度;A2为加入样液反应后的吸光度;A3为样液本底吸光度。
　　2 结果与分析
　　2.1 广金钱草多酚提取的单因素试验
　　2.1.1 提取剂的影响 由图1可以看出，在3种提取溶剂中，50%乙醇与50%甲醇所得多酚无显著差异，以水为提取溶剂多酚得率最小，这可能是因为广金钱草中的多酚物质极性较小，因而在水中的溶解度较低。综合比较几种溶剂的多酚得率并考虑到甲醇的毒性，本试验选择乙醇为提取溶剂。
　　2.1.2 乙醇体积分数的影响 从图2知，乙醇体积分数较低时，广金钱草多酚的得率随乙醇体积分数增加而增大;当乙醇体积分数达到40%时，广金钱草多酚的得率最高，随着乙醇体积分数再增大，得率逐渐降低。多酚是多羟基酚类化合物的混合物，不同的物质其多酚物质的组成不同，因而极性不同，需要选择与其极性相适应的溶剂使其溶出率最高。结果表明，乙醇體积分数为40%最适合提取广金钱草多酚。
　　2.1.3 料液比的影响 由图3可以看出，料液比（g·mL-1）从1∶10到1∶30，广金钱草多酚的得率逐渐增加，说明增加溶剂用量有助于多酚类物质的溶出;但料液比继续增大，多酚得率反而稍微降低，说明多酚类物质已基本提取完全，继续增大溶剂用量作用不大。所以料液比确定为1∶30。
　　2.1.4 提取温度的影响 从图4可以看出，随着温度的升高，广金钱草多酚的得率先增加后逐渐降低，可能是温度越高，多酚物质越不稳定。在40 ℃时得率最高，所以选择提取温度为40 ℃。
　　2.1.5 提取时间的影响 从图5可以看出，广金钱草多酚的得率随时间的延长先升高降低，60 min 时得率最高，可能是提取时间长会导致多酚类物质发生氧化等反应使其结构被破坏。后续试验选择提取时间为60 min。
　　2.1.6 提取次数的影响 由图6可以看出，随着提取次数增加，广金钱草多酚的得率无显著增加，提取1次已基本可将广金钱草多酚提取完全，增加提取次数的意义不大且使成本增加。 　　2.2 正交试验
　　根据单因素试验的结果进行正交试验，正交试验设计与结果见表1。极差分析结果表明，料液比对广金钱草多酚得率的影响较大，提取时间、温度和乙醇体积分数对广金钱草多酚得率的影响依次减少。根据正交表的直观分析，从广金钱草中提取多酚的最佳方案为A2B3C2D1，即40%乙醇，料液比（g·mL-1）1∶40，提取温度40 ℃，提取时间40 min，按此最佳提取条件进行验证试验，结果发现广金钱草多酚得率为（5.20±0.11） mg·g-1。
　　2.3 广金钱草多酚对DPPH·自由基清除能力的测定
　　DPPH·自由基清除试验是评价天然产物抗氧化活性的一种常用方法。半抑制浓度IC50值可用于评价物质的抗氧化活性，IC50值越大，抗氧化性越小[17]。由图7可以看出，广金钱草多酚以及Vc都能清除DPPH·自由基，且在试验质量浓度范围内对DPPH·自由基的清除能力都随质量浓度的升高逐渐增强。广金钱草多酚对DPPH·自由基的半抑制浓度IC50为（1.94±0.02） μg·mL-1，Vc对DPPH·自由基的半抑制浓度IC50值为（6.17±0.03） μg·mL-1，由此看出广金钱草多酚对DPPH·自由基的清除能力大于Vc。
　　2.4 广金钱草多酚对超氧阴离子自由基清除能力的测定
　　碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应生成超氧阴离子，这又会加速邻苯三酚的氧化，生成有颜色的中间产物，当有抗氧化剂存在时可清除超氧阴离子，将使反应溶液的吸光度减小[18]。由图8可以看出，在试验质量浓度范围内，广金钱草多酚与Vc对超氧阴离子自由基的清除能力都随质量浓度的增大而增大，量效关系明显。广金钱草多酚对超氧阴离子自由基的半抑制浓度IC50为（40.48±0.48） μg·mL-1，Vc对超氧阴离子自由基的半抑制浓度IC50为（136.0±1.9） μg·mL-1，可见广金钱草多酚对超氧阴离子自由基的清除能力大于Vc。
　　2.5 广金钱草多酚对亚硝酸根离子清除能力的测定
　　亚硝酸盐在人体内可生成强致癌物亚硝胺，因此，清除过量的亚硝酸盐可维护人体健康。由图9可以看出，在试验质量浓度范围内广金钱草多酚与Vc对亚硝酸根离子的清除能力都随着质量浓度的增大而增强，具有明显的量效关系。广金钱草多酚对亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50为（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc对亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50为（188.6±7.3） μg·mL-1。可见广金钱草多酚对亚硝酸根离子的清除能力大于Vc。
　　3 结论与讨论
　　提取多酚常用的方法是溶剂提取法，该法操作简单，成本低廉，常用的溶剂有水或者有机溶剂与水的混合溶液[19]。本文选择水、甲醇水溶液、乙醇水溶液作为提取溶剂，比较三者的提取效果，结果表明，广金钱草多酚只用水提取的效果较差，而甲醇、乙醇的水溶液两种溶剂的提取效果无显著差异，这可能是因为广金钱草中的多酚物质极性较小，因而在水中的溶解度较低。陈金玉等[20]的研究结果表明，龙眼核多酚提取量的高低顺序依次为：70%乙醇溶液>甲醇>水，与本文研究结果基本一致，而涂宗财等[21]的研究结果表明，不同溶剂提取物中红薯叶总酚含量的大小顺序为：水=甲醇>乙醇，与本研究结果不同，可能是样品种类不同，其多酚的组成不同，不同溶剂的提取效果就不同。本文采用乙醇水溶液作为提取溶剂，这与一些文献提取多酚所选用的溶剂[20，22-23]一致，本文研究表明，40%的乙醇溶液为广金钱草多酚的最合适提取溶剂，乙醇浓度过大或过小，会造成样品中多酚物质无法有效溶出。在料液比（g·mL-1）1∶40、温度40 ℃、时间40 min的条件下，提取1次即可提取完全并得到最好的提取效果，多酚得率为（5.20±0.11）  mg·g-1。
　　近年来，天然产物的研究热点之一就是从植物中寻找抗氧化活性成分。评价多酚抗氧化性的方法有清除DPPH·自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸根离子、羟基自由基以及总还原力等方法，本文选取了前三种方法作为评价广金钱草多酚抗氧化活性的方法。本文研究表明，在一定浓度范围内，广金钱草多酚清除DPPH·的能力随质量浓度增加而增大，广金钱草多酚清除DPPH·的半抑制浓度IC50为（1.94±0.02） μg·mL-1，Vc的IC50则为（6.17±0.03） μg·mL-1。曹伟伟等[24]的研究表明，花生红衣多酚与Vc清除DPPH·的IC50分别为4.61 μg·mL-1、10.26 μg·mL-1，卜凡琼等[25]的研究表明，徐香猕猴桃多酚与Vc清除 DPPH·的IC50 分别为3.5 μg·mL-1、3.9 μg·mL-1，邓疆等[26]的研究表明，印度黄檀叶多酚与Vc清除DPPH·的IC50分别为3.2 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1，说明广金钱草多酚与花生红衣、徐香猕猴桃一样，清除DPPH·的能力都强于Vc，且其清除DPPH·的能力强于花生红衣、徐香猕猴桃以及印度黄檀叶三种植物的多酚。广金钱草多酚清除 O2-·的IC50为（40.48±0.48） μg·mL-1，Vc的IC50则为（136.0±1.9） μg·mL-1。卜凡琼等[25]的研究表明，徐香猕猴桃多酚和Vc清除O2-·的IC50分别为438.6 μg·mL-1、773.1 μg·mL-1，梁杏等[27]的研究表明，核桃饼粕多酚和Vc清除O- 2·的IC50 分别为202.83 μg·mL-1、41.94 μg·mL-1，洪璇等[28]的研究表明，鸡桑叶多酚和Vc清除O2-·的IC50分别为 416.05 μg·mL-1、244.21 μg·mL-1。由此说明广金钱草多酚清除O2-·的能力强于徐香猕猴桃多酚、核桃饼粕多酚以及鸡桑叶多酚。广金钱草多酚清除亚硝酸根离子的IC50为（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc的IC50为（188.6±7.3） μg·mL-1。林栋等[29]的研究表明，贵长猕猴桃多酚与Vc对亚硝酸盐清除作用的IC50 分别为77 μg·mL-1、159 μg·mL-1，马婷婷等[30]的研究表明，黄参茎叶多酚清除亚硝酸盐的能力低于Vc ，谢碧秀等[31]的研究表明，油橄榄果渣多酚对于亞硝酸盐的清除能力低于Vc。由此可见广金钱草多酚清除亚硝酸根离子的能力低于贵长猕猴桃多酚，但强于黄参茎叶多酚和油橄榄多酚。 　　广金钱草中的多酚含量（5.20±0.11 mg·g-1）低于花生红衣（173.2 mg·g-1）[24]、印度黄檀叶（30.8  mg·g-1）[26]、鸡桑叶（87.63 mg·g-1）[28]、黄参茎叶（82.9 mg·g-1）[30]中的多酚含量，高于徐香猕猴桃（0.623 5 mg·g-1）[25]与贵长猕猴桃（3.03±0.07 mg·g-1）[29]中的多酚含量，但广金钱草多酚除了清除亚硝酸盐的能力比贵长猕猴桃弱以外，清除DPPH·的能力强于花生红衣多酚、徐香猕猴桃多酚以及印度黄檀叶多酚，清除O2-·的能力强于徐香猕猴桃多酚、核桃饼粕多酚以及鸡桑叶多酚，因此，广金钱草多酚的含量虽然并不高，但其抗氧化能力较强，可能是由于不同植物多酚的组成不同引起的。综上所述，在所选择的三种抗氧化体系中，广金钱草多酚的半抑制浓度IC50均比Vc的IC50小，说明其与Vc相比，具有更高的抗氧化活性，是一种良好的天然抗氧化剂。
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