白刺的原生质体制备与培养

来源:用户上传      作者: 胡燕 郭成金

　　摘 要：以西伯利亚白刺幼苗子叶为材料，采用L9（34）正交试验，比较酶组合、渗稳剂甘露醇浓度、酶解温度和酶解时间对其原生质体制备的影响。试验结果表明，适宜酶解条件为1% 纤维素酶Onozuka R-10+0.2% 果胶酶 Y-23+0.8 mol・L-1甘露醇，28 ℃下酶解3.5 h。而且，经过预处理的子叶，其原生质体得率优于未处理的。在MS+2,4-D 1 mg・L-1+6-BA 0.5 mg・L-1+0.7 mol・L-1甘露醇的固液双层培养基中，原生质体能形成细胞团。
　　关键词： 白刺；预处理；原生质体制备；原生质体培养；细胞团
　　中图分类号：R285.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.06.006
　　
　　Protoplast Preparation and Culture of Nitraria sibirica Pall.
　　HU Yan, GUO Cheng-jin
　　（College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387，China）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ: The cotyledons of Nitraria sibirica Pall. were used as materials in this work.The effects of combinations of enzyme mixture，the concentration of mannitol，the temperature and the time of enzymolysis on the protoplast preparation were studied by orthogonal design with L9（34）. The results showed that the optimal preparing condition was by 1% cellulase(Onozuka R-10)+0.2% Pectolyase Y-23+0.8 mol・L-1 mannitol for 3.5 h,under 28 ℃. However, under the same conditions, more protoplast would be get from the cotyledons which had been treated by tissue culture. Besides, protoplast were cultured in solid-liquid double MS medium containing 2,4-D 1 mg・L-1+6-BA 0.5 mg・L-1+0.7 mol・L-1 mannitol, and then developed into cell cluster.
　　Key words: Nitraria sibirica Pall.；pretreatment；protoplast preparation； protoplast culture；cell cluster
　　
　　西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall.)隶属于蒺藜科，白刺属。其浆果状核果又称卡密、沙樱桃、酸胖，熟时暗红色，含有大量红色色素，富含氨基酸、微量元素、黄酮、VC等各类生理活性物质。白刺果可药食两用，具有健脾胃、调经活血、降压等功效，可用于治疗消化不良、月经不调和高血压、头晕等症[1]。近年来，还发现白刺果油含有丰富的维生素E成分，具有较强抗氧化性作用[2]。
　　西伯利亚白刺是丛状小灌木，匍匐地面生长[3]。它能生长在土壤含盐量2.5%～3.15%、pH值＞8的重盐碱土中，是重盐碱土指示植物。可固沙护坡、改良盐碱地、绿化、观赏[4]。该植物的组织培养和快速繁殖已有报道[5-7]，而原生质体制备尚未见报道。白刺原生质体的高效制备对其诱变和细胞杂交育种及丰富原生质体技术等具较高的理论和实践意义。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　西伯利亚白刺果实采自天津滨海新区大港马圈村盐碱地。
　　1.2 试验试剂
　　MS培养基，6-BA，IBA，琼脂（天津市珠江卫生材料厂），甘露醇，果胶酶Y-23（北京鼎国生物技术有限责任公司），纤维素酶R-10、离析酶R-10(北京普博欣生物技术有限公司)。
　　CPW溶液：KH2PO4 27 . 2 mg・L-1、KNO3 101 mg・L-1、 MgSO4・7H2O 246 mg・L-1 、KI 0.16 mg・L-1、CuSO4 0.025 mg・L-1 、CaCl2・2H2O 1 480 mg・L-1。
　　所有化学试剂均为分析纯试剂。
　　1.3 试验仪器
　　YXQG02手提式压力蒸汽消毒器(山东新华医疗器械厂)，SW-CJ-2超净工作台(上海锦屏仪器仪表有限公司)，Galen显微镜(Gambrige)，BS224S电子天平(Sartorius)， RZH-158A型人工气候培养箱（杭州汇尔仪器设备有限公司），PB-10普及型pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司），HH・S21-4电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂），H-1650台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
　　1.4 培养基
　　实生幼苗子叶组培培养基：MS+1 mg・L-1 6-BA +0.5 mg・L-1 IBA +8 g・L-1琼脂。
　　原生质体液体培养基Ι/渗透压稳定剂/清洗液：MS+2,4-D 1 mg・L-1+6-BA 0.5 mg・L-1+0.7 mol・L-1甘露醇。
　　原生质体液体培养基Ⅱ：MS+2,4-D 1 mg・L-1+6-BA 0.5 mg・L-1+0.4 mol・L-1甘露醇。
　　原生质体再生固体培养基：原生质体液体培养基Ι+8 g・L-1琼脂。
　　以上培养基 pH值均为5.8。
　　1.5 试验方法
　　1.5.1 子叶及预处理 果实晒干后，置-20 ℃冰箱保存。经过1~2个月后取出，温水浸泡，搓取洗净种子，每天换水浸泡使其吸足水分后，以种子与洁净湿沙为1∶3混合置25 ℃恒温催芽至露白，播种发芽[8]。待其种子发芽至子叶展出，真叶初露时，将整株幼苗经70%乙醇浸泡20 s，无菌水洗3次，然后转入0.1%HgCl2溶液中浸泡6 min，无菌水冲洗5次，切取其子叶作为试验材料。
　　将已消毒后的整株幼苗，切去根及下胚轴的白色部分，接种于幼苗子叶组培预处理的培养基中，置于人工气候箱，以25 ℃，2 000 Lx，14 h光照，10 h黑暗培养3～5 d后，切取其子叶作为预处理的试验材料。
　　1.5.2 酶液配制 CPW溶液+5 mmol・L-1 MES配制的各组酶解液，pH值5.8，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
　　1.5.3 原生质体分离、纯化及培养 将经消毒处理后切下的子叶，切成约1 mm×1 mm的小方块，与酶液1∶10（质量体积比）的比例，恒温水浴，于黑暗条件下酶解，每20 min轻轻摇晃数下。酶解结束后过0.05 mm筛，将滤液收集在离心管中。吸取少量过滤液于血球计数板上，在显微镜下观察，测定原生质体的产量，重复3次。计算方法如下：

　　平均每个大方格的原生质体数= 5个大方格悬浮液的原生质体总数/5
　　1 mL悬浮液中原生质体数=平均每个大方格（0.1 mm3,即0.1 μL）的原生质体总数×10×1 000滤液放置5 mL离心管中，800 r・min-1离心5 min，弃去上清液。沉淀用原生质体培养液Ⅰ悬浮，再次离心洗涤1次，收集到的原生质体再以原生质体培养液悬浮，使原生质体密度约为4×104・mL-1，取1 mL涂布在直径为6 cm培养皿的固体培养基上，进行暗培养，8 d后，加入1 mL原生质体培养液Ⅱ，适当降低甘露醇浓度。
　　1.5.4 原生质体制备正交试验设计 试验采用L9（34）正交设计，共16组处理。比较酶组合、渗稳剂甘露醇浓度、酶解温度和酶解时间对白刺原生质体制备的影响，从而确定其制备的适宜条件。
　　
　　2 结果与分析
　　2.1 原生质体制备适宜条件
　　据表3对4因素极差（R）进行比较，按级差值大小顺序排列，其顺序分别为C＞A＞D＞B。因此，影响白刺原生质体制备的主要因素是酶解温度和酶组合，其次为酶解时间与甘露醇浓度。
　　
　　根据水平之间K值大小比较得知，白刺原生质体制备适宜体系为A1B2C2D2，即：1%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8 mol・L-1甘露醇酶解液，28 ℃酶解3.5 h。此体系经3次重复试验进行验证，原生质体制备率均达4×104・mL-1。
　　2.2 原生质体制备的影响因素分析
　　2.2.1 酶组合对原生质体制备的影响 据A因素中K值比较，在1%纤维素酶相同的情况下，0.2%的果胶酶Y-23的酶解效果优于另外两种组合。
　　构成植物细胞壁的3个主要成分是：纤维素占25%～50%；半纤维素占53%；果胶质占5%。一般认为原生质体的分离，纤维素酶和果胶酶是必要的[9]。白刺幼苗真叶初露时的子叶，纤维化程度不高，经这两种酶的作用后足以释放出原生质体。若两种酶浓度过大，势必会加大对原生质体膜的损伤。
　　
　　 2.2.2 甘露醇浓度对原生质体制备的影响 甘露醇作为渗透调节剂在很多研究中得到应用，是一种代谢性的吸收性的糖醇[10]。
　　虽然正交试验中甘露醇浓度这一因素对白刺原生质体制备的影响不大，其级差值在4个级差值中最小，初步分析0.7 mol・L-1、0.8 mol・L-1和0.9 mol・L-1是在白刺原生质体能忍受的渗透压力范围内，但通过比较K值不难发现，0.8 mol・L-1甘露醇试验组酶解的效果优于 0.7 mol・L-1和 0.9 mol・L-1，故推测0.8 mol・L-1的甘露醇浓度较接近于白刺原生质体自身的渗透压。
　　2.2.3 酶解温度对原生质体制备的影响 温度直接影响酶的活性，但酶解温度过高，就会间接影响到原生质体膜的稳定性。试验中，酶解温度是影响原生质体制备的首要因素，由此可见，酶解温度对整个酶解反应十分重要。根据C因素中K值比较，在原生质体制备的试验中，以 28 ℃最为适宜，相对而言，30 ℃的酶解温度极有可能已影响到膜的稳定性。
　　2.2.4 酶解时间对原生质体制备的影响 在同一酶解条件下，一般酶解时间长，原生质体的产率高，但酶解时间过长导致细胞壁碎片急剧增多，而且较早游离出来的原生质体也会出现破裂现象[9]。
　　试验中，酶量相对较低总量为1.2%，酶解时间相对较短，为2.5，3.5，4.5 h，通过正交试验结果分析得知，酶解时间对原生质体制备的影响很小。
　　2.2.5 预处理对原生质体制备的影响 经过预处理后的子叶在适宜酶解体系下，即1%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8 mol・L-1甘露醇酶解液，28 ℃酶解3.5 h，原生质体制备率达9×104・mL-1。
　　根据Rayle和Cleland于1970年提出的生长素作用机理的酸生长理论，在酸性的条件下，H+一方面可使细胞中对酸不稳定的化学键（如氢键）断裂，同时也使细胞壁中的某些多糖水解酶（如纤维素酶、XET）活化或增加，从而使连结木葡聚糖与纤维素微纤丝之间的键断裂，细胞壁松弛[11]。
　　该理论正好可以解释这个现象――经过预处理，即在MS+1mg・L-1 6-BA +0.5 mg・L-1 IBA的培养基中培养3～5 d，生长素促使白刺的细胞壁松弛。与未进行预处理的相比较而言，经过预处理的白刺子叶能释放出更多的原生质体。
　　2.3 原生质体的培养
　　以正交试验得出的适宜酶解条件，对经消毒后的白刺幼苗子叶，进行原生质体的分离。原生质体经离心纯化后，在25 ℃的暗箱中，固液培养。培养约48 h时原生质体就能再生出细胞壁；5 d后，开始出现细胞第一次分裂，但多数细胞呈椭圆状，即将要分裂；约30 d后，显微镜下观察到的细胞团，细胞大小比较规则，排列稍松散。刮取培养基表面一层（含有细胞团和培养基），涂布在未加渗稳剂的原生质体培养基中，进行培养；约40 d后，能看见直径约0.5 mm的白色愈伤组织，图4为60 d后所拍愈伤组织。
　　
　　试验表明，由萌发脱壳后生长3～4 d的子叶制备出的原生质体，具备再生出细胞团的能力，而待到真叶初露时的子叶制备出的原生质体却很难再生出细胞团。分析原因为，萌发脱壳3～4 d的子叶较真叶初露时的子叶幼嫩，细胞活性高，酶解分离得到的原生质体再生能力强。
　　3 结 论
　　以白刺幼苗的子叶进行正交酶解条件试验，结果表明，适宜的酶解条件为1%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8 mol・L-1甘露醇酶解液，28 ℃酶解3.5 h，原生质体制备率达4×104・mL-1。而经过组培预处理的子叶，在相同的酶解条件下，原生质体制备率达9×104・mL-1。
　　培养由白刺幼苗子叶获得的原生质体时，培养基中很少出现内生菌现象。而培养经预处理幼苗的子叶时，培养基中经常会出现内生菌的现象。这一问题还有待于进一步的研究。
　　由萌发脱壳后生长3～4 d的子叶较幼嫩，制备出的原生质体再生能力强，能形成细胞团。可见，材料的生长状态对原生质体再生有着非常重要的影响。
　　白刺原生质体的制备及其培养，为诱变遗传育种、细胞融合育种及丰富原生质体技术，尤其是为白刺原生质体的再生、无菌苗的获得奠定了基础。而白刺的无菌苗也能为研究白刺内生菌提供材料来源。
　　
　　参考文献：
　　[1] 朱芸，刘金荣，成玉怀，等.新疆西伯利亚白刺果红色素稳定性的研究[J].食品科学，2008,29（3）:113-115.
　　[2] 樊莲莲，刘金荣，苏文成，等.西伯利亚白刺果油对衰老模型小鼠抗氧化性作用的研究[J].石河子大学学报：自然科学版，2007,25（2）：207-210.
　　[3] 张光玉，江苏燕.天津湿地与古海岸遗迹[M].北京：中国林业出版社，2008:93.
　　[4]天津滨海新区管理委员会.天津滨海盐生植物[M].北京：中国林业出版社，2007：21.
　　[5] 其其格，李双福，张启昌，等.西伯利亚白刺的丛生芽诱导剂快速繁殖[J].园艺学报，2007,34（3）：791-792.
　　[6] 张启昌，李双福，其其格.西伯利亚白刺的微繁技术[J].东北林业大学学报，2008,36（4）：12-13.
　　[7] 王晨霞，陈贵林.西伯利亚白刺的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2007,43（6）：1143-1144.
　　[8] 林栖凤.耐盐植物研究[M].北京：科学出版社，2004:308.
　　[9] 陈爱萍，罗玉鹏，姜婷娜，等.不同酶液组合及酶解时间对普通红豆草原生质体游离的影响[J].新疆农业大学学报，2008,31（2）：29-32.
　　[10]肖望.香蕉（Musa spp.）原生质体培养及体细胞杂交的研究[D].广州：中山大学，2007.
　　[11] 郝建军，康宗利.植物生理学[M].北京：化学工业出版社，2005：165.

转载注明来源:https://www.xzbu.com/8/view-51042.htm