伊维菌素对人胃癌细胞BGC—823、MGC—803迁移和侵袭的影响及机制研究

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　　中圖分类号 R735.2；R361+.3 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）05-0621-07
　　DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.09
　　摘 要 目的：研究伊维菌素对人胃癌细胞BGC-823、MGC-803迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法：0、2.5、5、10、20、40 μmol/L伊维菌素分别作用于BGC-823、MGC-803细胞24 h后用MTT法检测细胞抑制率，再采用Transwell小室侵袭实验观察5 μmol/L伊维菌素和含0.67‰二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液（对照组）作用24 h对BGC-823、MGC-803细胞迁移和侵袭的影响，Western blot法分别检测5、10 μmol/L伊维菌素和含0.67‰二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液（对照组）作用于BGC-823、MGC-803细胞24 h后上皮-间质转化（EMT）标记物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和EMT转导通路转化生长因子β（TGF-β）/Smad中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3 蛋白的表达水平。结果：伊维菌素对BGC-823、MGC-803细胞生长均有抑制作用，其细胞抑制率与其浓度呈正相关。与对照组比较，5 μmol/L伊维菌素作用后BGC-823、MGC-803细胞的迁移数和侵袭数均明显减少（P<0.01或P<0.001）；5、10 μmol/L伊维菌素作用后BGC-823、MGC-803细胞中E-cadherin蛋白表达明显增强（P<0.05或P<0.01或P<0.001），N-cadherin、Vimentin、Snail、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白表达均明显减弱（P<0.05或P<0.01或P<0.001），TGF-β1蛋白仅在10 μmol/L伊维菌素作用后明显减弱（P<0.05）。结论：伊维菌素能显著抑制BGC-823、MGC-803细胞的迁移和侵袭，其可能与抑制TGF-β/Smad活性从而影响EMT过程有关。
　　关键词 伊维菌素；人胃癌细胞BGC-823；人胃癌细胞MGC-803；转化生长因子β/Smad；细胞迁移；细胞侵袭
　　Effects of Ivermectin on Migration and Invasion of Human Gastric Cancer Cells BGC-823 and MGC-803 and Its Mechanism
　　XIE Yanjiao1，KUANG Shaoyi2，DENG Huiming3，YU Daorui2，FAN Haofei2，JIA Hao2，LIU Qiang2（1.Dept. of Pharmacy， Hainan Provincial People’s Hospital， Haikou 570311， China；2.Dept. of Pharmacology， Hainan Medical College， Haikou 571199， China；3.Dept. of Gastrointestinal Tumor Surgery， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570102， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ivermectin on the migration and invasion of human gastric cancer cell lines BGC-823 and MGC-803 and its mechanism. METHODS： After treated with 0， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L ivermectin for 24 h， inhibitory rate of human gastric cancer cell lines BGC-823 and MGC-803 were detected by MTT assay. Effects of 5 μmol/L ivermectin and phosphate buffercontaining 0.67‰ dimethyl sulfoxide （control group） for 24 h on the migration and invasion of` gastric cancer cells BGC-823 and MGC-803 were observed by Transwell chamber invasion assay.Western blot assay was used to detect the protein expression of TGF-β1， TGF-βR， Smad2 and Smad3 in epithelial-mesenchymal transition （EMT） markers E-cadherin， N-cadherin， Vimentin， Snail and EMT transduction pathway TGF-β/smad of BGC-823 and MGC-803 cells after treated with 5， 10 μmol/L ivermectin and phosphate buffercontaining 0.67‰ dimethyl sulfoxide （control group） for 24 h. RESULTS： Ivermectin could inhibit the growth of BGC-823 and MGC-803， inhibitory rate of it was positively correlated with its concentration. Compared with control group， the number of migration and invasion BGC-823 and MGC-803 cells were decreased significantly after treated with 5 μmol/L ivermectin （P<0.01 or P<0.001）； the expression of E-cadherin protein was enhanced significantly in BGC-823 and MGC-803 cells after treated with 5 and 10 μmol/L ivermectin （P<0.05 or P<0.01 or P<0.001）； the protein expression of N-cadherin， Vimentin， Snail， TGF-βR， Smad2 and Smad3 were decreased significantly （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）； protein expression of TGF-β1 was decreased significantly after treated with 10 μmol/L ivermectin （P<0.05）. CONCLUSIONS： Ivermectin can significantly inhibit the migration and invasion of gastric cancer cells BGC-823 and MGC-803， and inhibiting the biological activity of EMT by reducing the expression of TGF-β/smad pathway is one of the mechanisms that inhibit the migration and invasion of gastric cancer cells. 　　KEYWORDS Ivermectin； Human gastric cancer cell BGC- 823； Human gastric cancer cell MGC-803； TGF-β/Smad； Cell migration； Cell invasion
　　胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在恶性肿瘤疾病中位居前列[1]。Lancet发布的2000-2014年全球癌症生存率变化趋势监测研究报告显示，我国胃癌的5年生存率仅为35.9%，明显低于韩国（68.9%）、日本（60.3%）等发达国家[2]。由于胃癌的早期临床症状不明显，当确诊时多数已为中、晚期并伴有远处转移[3]。虽然有研究表明，腹腔镜微创切除术结合亚叶酸钙、奥沙利铂、氟尿嘧啶新辅助化疗方案用于进展期胃癌具有显著疗效，但患者的远期存活率仍然很低，而胃癌细胞向邻近器官侵袭和远处转移是影响胃癌患者生存期的主要因素之一[4-5]。目前转移性胃癌的治疗方式主要是以手术和放化疗为主，但手术清除率低、放化疗副作用大一直影响着转移性胃癌的治疗效果[6]。因此，寻找新的转移性胃癌的治疗方式已成为亟待解决的医学问题。
　　伊维菌素（Ivermectin）是在日本Kitasato研究所发现由放线菌阿维链霉菌发酵产生的16元大环内酯化合物，属于阿维菌素类，是新型抗寄生虫药，还广泛用于农业、兽医和水产养殖等行业，具有高效、广谱、低毒等特点[7-9]。有研究表明，伊维菌素可作为线粒体功能障碍和氧化损伤的诱导物从而具有抑制肾癌细胞生长的作用[10]，也能够诱导乳腺癌细胞自噬增加进而抑制细胞的生长[11]，还可以作为肿瘤细胞多药耐药的抑制剂[12]。由此可见，伊维菌素不仅有望作为抗肿瘤药物在临床上推广应用，还可作为“老药新用”节约抗肿瘤新药的研发成本。上皮-间质转化（Epithelial mesenchymal transitions，EMT）是肿瘤细胞向周围浸润和远处转移的重要机制，当肿瘤发生EMT后，肿瘤细胞间黏附能力下降，浸润和转移能力增强，从而突破基底膜侵入肿瘤周围组织或进入血液循环向远处转移[13]。已有多项研究表明，EMT与结肠癌、胃癌、肺癌细胞的转移和侵袭密切相关[14-16]。因此，本文结合国内外的研究现状，探讨伊维菌素是否能够抑制人胃癌细胞BGC-823、MGC-803的迁移和侵袭以及其作用机制，以期为伊维菌素的合理应用提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　3111二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司）；BX43正置荧光显微镜（日本Olympus公司）；SW-CJ-2D 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；SpectraMax plus384全波长酶标仪（美国MD公司）；TGL-16M台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TDZ6B-WS台式低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪和 Mini-Protein Tetra System电泳转印系统（美國Bio-Rad公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　伊维菌素对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号：I854556，纯度：≥98%）；RPMI-1640培养基、0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）、青链双抗、胎牛血清（FBS）均购于美国Gibco公司；MTT试剂盒（批号：022817170401）、二辛可宁酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号：112416170410）均购于上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室和基质胶均购自美国Corning公司；兔抗E-钙黏蛋白（E-cadherin）、神经钙黏附蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、编码锌指蛋白转录因子（Snail）、1型转化生长因子β（TGF-β1）、转化生长因子β受体（TGF-βR）、Smad2、Smad3、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体和山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗体均购自美国Abcam公司。
　　1.3 细胞
　　人胃癌细胞BGC-823、MGC-803均购自中国科学院上海细胞库。
　　2 方法
　　2.1 MTT法检测胃癌细胞抑制率
　　选取处于对数生长期的BGC-823、MGC-803细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数后调整细胞密度，按每孔 5×103个/100 ?L接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入伊维菌素浓度分别为2.5、5、10、20、40 ?mol/L的含0.67‰二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液（PBS）（后文均称为伊维菌素溶液），同时设置对照组加入含0.67‰ DMSO的PBS（由于DMSO含量极少，后文均称为PBS），每组设5个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，于终止培养前4 h加入10 μL MTT（5 mg/mL），继续37 ℃孵育4 h，弃去培养液，每孔加入 150 ?L DMSO，用全波长酶标仪在570 nm下测定吸光度（A值），计算细胞抑制率（%）=1-给药组A值/对照组A值×100%。
　　2.2 Transwell小室试验检测细胞的迁移和侵袭
　　2.2.1 迁移 选取处于对数生长期的BGC-823、MGC-803细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗2遍，无血清的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度至5×105 mL-1。上室均匀加入200 ?L细胞悬液，试验组再加入伊维菌素溶液5 ?mol/L，对照组加入相应体积的PBS；下室加入含10% FBS的RPMI-1640培养基600 ?L，每组设5个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取出上室，用棉签擦去上室细胞，PBS漂洗后用多聚甲醛固定15 min，弃固定液，0.1%结晶紫染液染色10 min，PBS洗3遍，每次10 min，显微镜下摄片并计数结晶紫染色的细胞迁移数。 　　2.2.2 侵袭 将Transwell 小室置于24孔板内，每孔铺基质胶50 μL，再按“2.2.1”项下条件加入细胞和药液，每组设5个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，刮除上室中的基质胶和细胞，按“2.2.1”项下方法固定、染色，显微镜下摄片并计数结晶紫染色的细胞侵袭数。
　　2.3 Western blot法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白的表达
　　选取处于对数生长期的BGC-823、MGC-803细胞，按1×105个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后分别给予伊维菌素5、10 ?mol/L（伊维菌素低、高浓度组）以及PBS（对照组），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培養24 h后，提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度，加入5×十二烷基硫酸钠（SDS）加样缓冲液混合，95%变性10 min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入EMT标志蛋白抗体[兔抗E-cadherin（1 ∶ 1 000）、N-cadherin（1 ∶ 1 000）、Vimentin（1 ∶ 1 000）、Snail（1 ∶ 1 000）单克隆抗体]、TGF-β/Smad通路蛋白抗体[TGF-β1（1 ∶ 1 000）、TGF-βR（1 ∶ 1 000）、Smad2（1 ∶ 1 000）、Smad3（1 ∶ 1 000）单克隆抗体]和内参抗体[β-actin（1 ∶ 1 000）单克隆抗体]，4 ℃孵育过夜，洗膜后按 1 ∶ 2 000 加山羊抗兔IgG抗体，室温孵育2 h，洗膜，采用增强化学发光试剂盒曝光，Quantity one图像分析软件分析目的条带和内参条带的A值，计算相对表达量。试验重复3次。
　　2.4 统计学方法
　　细胞迁移和侵袭数量用ImagePro Plus软件进行计数，蛋白表达的灰度值用Image J软件测定，统计图用GraphPad Prism 6软件制作，数据结果用 x±s表示。采用SPSS 21.0软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析和Student’s t检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 细胞抑制率
　　与对照组比较，2.5、5、10、20、40 ?mol/L的伊维菌素对BGC-823细胞的抑制率分别为0.12±0.04、0.25±0.03、0.34±0.06、0.43±0.03、0.55±0.04，差异均有统计学意义（P<0.05）；对MGC-803细胞的抑制率分别为0.09±0.03、0.24±0.04、0.43±0.07、0.62±0.04、0.79±0.03，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果表明，伊维菌素对BGC-823、MGC-803细胞的生长均有明显的抑制作用，且伊维菌素浓度越高、抑制作用越强，呈明显的量效关系。伊维菌素对BGC-823、MGC-803细胞抑制率的影响见图1。
　　3.2 迁移和侵袭
　　3.2.1 迁移 试验组BGC-823、MGC-803细胞的迁移数分别为（49.8±17.0）、（37.0±8.1）个（n=5），均明显少于对照组的（125.2±12.5）、（83.4±13.2）个（n=5），差异均有统计学意义（P<0.01或P<0.001）。2组BGC-823、MGC-803细胞迁移的显微镜图见图2，测定结果见图3。
　　3.2.2 侵袭 试验组BGC-823、MGC-803细胞的侵袭数分别为（51.4±15.6）、（34.0±6.5）个（n=5），明显少于对照组的（130.0±18.0）、（67.0±8.5）个（n=5），差异均有统计学意义（P<0.001）。2组BGC-823、MGC-803细胞侵袭的显微镜图见图4，测定结果见图5。
　　3.3 EMT标志蛋白表达
　　与对照组比较，伊维菌素低、高浓度组BGC-823、MGC-803细胞中E-cadherin蛋白的表达明显升高（P<0.05或P<0.01），N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达明显降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。表明伊维菌素可能是通过影响胃癌细胞EMT过程从而抑制细胞的迁移和侵袭。3组BGC-823、MGC-803细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达的电泳图见图6，测定结果见图7。
　　3.4 TGF-β/smad信号通路蛋白表达
　　与对照组比较，除伊维菌素低浓度组BGC-823细胞中TGF-β1和MGC-803细胞中Smad3外，伊维菌素低、高浓度组BGC-823、MGC-803细胞中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白的表达均明显降低（P<0.05或P<0.01）。表明伊维菌素可能通过明显抑制TGF-β/smad信号通路活性，从而抑制EMT过程，进而减弱胃癌细胞的迁移和侵袭能力。3组BGC-823、MGC-803细胞中TGF-β1、TGF-βR、Smad2、Smad3蛋白表达的电泳图见图8，测定结果见图9。
　　4 讨论
　　近年来多项研究报告表明，“老药新用”也是发展药物抗肿瘤治疗的新途径之一，例如阿司匹林和二甲双胍能明显提高结直肠癌患者的生存率[17-18]。因老药具有众所周知的药动学和药效学概况，所以与新研发的抗肿瘤药物相比，老药具有研究成本低、风险小、成功率高等优势。本研究结果发现，抗寄生虫药伊维菌素也可明显抑制BGC-823、MGC-803细胞的生长，明显减弱其迁移和侵袭能力，这与国外Nambara S等[19]学者报道一致，提示伊维菌素具有发展为抗肿瘤药物的潜力。 　　EMT對肿瘤的迁移和侵袭起着重要的调节作用，在EMT过程中皮标志物E-cadherin的表达会降低，而间充质标志物N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达通常会增强[20-21]。当由上皮组织衍生出来的肿瘤组织中E-cadherin的表达降低或者是缺失时（被认为是EMT的关键步骤），E-cadherin向N-cadherin转化并促进其表达，形态上由上皮细胞转化为具有间充质特征，这时具有间质细胞表型的上皮细胞活动性更强且具有较低的极性，进而增强肿瘤细胞的能动性和侵袭性[22-23]。因此当靶向EMT抗肿瘤药物干预后，肿瘤细胞内常伴随着E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达异常。本研究结果发现，伊维菌素可升高E-cadherin蛋白的表达，降低N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达，提示伊维菌素可通过调节EMT 过程从而抑制 BGC-823、MGC- 803细胞的迁移和侵袭能力。
　　TGF-β对肿瘤细胞有着双重调节作用，在肿瘤发生早期，TGF-β可以促进肿瘤细胞凋亡抑制其生长，但在晚期TGF-β可以促进肿瘤细胞转移，因此TGF-β也是调节EMT过程的重要细胞因子[24-25]。Smads蛋白是TGF-β细胞内信号传导的重要蛋白，是将信号由胞浆传导至细胞核的承接者。转录因子Smads家族中Smad2、Smad3是TGF-β转导通路下游关键的蛋白分子，属受体激活型，活化的TGF-β1与TGF-βR结合后活化Smad2、Smad3的磷酸化，与Smad4结合形成聚合物进入细胞核调节靶基因转录[26]。有研究表明，TGF-β/Smad信号通路可通过调控EMT过程，对胰腺癌细胞和肝癌细胞的转移和侵袭发挥正性作用[27-28]。因此笔者也推测伊维菌素可以影响TGF-β/Smad信号通路的表达。本研究结果表明，伊维菌素作用胃癌细胞24 h后，TGF-β1、TGF-βR表达明显降低，转录因子Smad2、Smad3的表达也降低，提示伊维菌素是通过抑制TGF-β/Smad的活性影响EMT过程，从而抑制BGC-823、MGC-803细胞的迁移和侵袭作用。
　　综上所述，伊维菌素具有抑制BGC-823、MGC-803细胞的迁移和侵袭作用，其作用机制可能为抑制TGF-β/Smad的活性从而影响EMT过程。但是其如何影响TGF-β/Smad信号通路调控EMT的作用机制尚需进一步研究。
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　　（收稿日期：2018-09-16 修回日期：2019-01-14）
　　（编辑：邹丽娟）
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