扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达影响的研究

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　　摘要 目的：研究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响。方法：针对筛选出的MexAB-OprM陽性的铜绿假单胞菌菌株，通过微量稀释法，测定哌拉西林-他唑巴坦的最小抑菌浓度和扶正解毒化瘀方水提物的最小杀菌浓度，从而确定荧光定量PCR细菌样本时培养剂中哌拉西林-他唑巴坦和扶正解毒化瘀方水提物的浓度。绘制细菌生长曲线，确定细菌样本的培养时间。利用实时荧光定量PCR技术检测药物干预前后mexB、oprM、mexR的表达量。结果：扶正解毒化瘀方水提物能降低MexAB-OprM外排泵阳性MDRPA菌株的mexB、oprM表达量（P<0.05），同时能增加mexR的表达量（P<0.05）。结论：扶正解毒化瘀方对MDRPA所致肺炎的作用机制之一可能是通过抑制MexAB-OprM外排泵的表达实现的。
　　关键词 扶正解毒化瘀方;多重耐药铜绿假单胞菌;外排泵;MexAB-OprM;最小抑菌浓度;生长曲线;实时荧光定量PCR;作用机制
　　Effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the Expression of Efflux Pump MexAB-OprM of Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa
　　Wang Yuting1，Xu Hongri2，Zhao Shitong1，Cheng Miao1，Yao Xingwei3，Chang Guijiao3，Chen Shilin1，Wang Chengxiang4
　　（1 Respiratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Emergency Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China; 3 Clinical Laboratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 4 Respiratory Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China）
　　Abstract Objective：To study the effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the expression of MexAB-OprM efflux pumps in multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.Methods：The minimum inhibitory concentration of piperacillin-tazobactam and the minimum bactericidal concentration of the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction were determined via microdilution method for selected MexAB-OprM positive Pseudomonas aeruginosa strains so as to determine the concentration of piperacillin-tazobactam and the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction in the culture medium during the fluorescence quantitative PCR of bacterial samples.The bacterial growth curve was drawn and the culture time of the bacterial samples was determined.The expression levels of mexB，oprM，and mexR before and after drug intervention were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technology.Results：The expression levels of mexB and oprM in MexB-OprM efflux pump positive strains were decreased after the intervention of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction water extract（P<0.05），and that of mexR was increased than before（P<0.05）.Conclusion：The therapeutic effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on pneumonia caused by MDRPA may be attributed to the inhibition of the expression of MexAB-OprM efflux pump.
　　Key Words Fuzheng Jiedu Huayu Decoction; Pseudomonas aeruginosa; Efflux pump; MexAB-OprM; Minimum inhibitory concentration; Growth curve; Real-time fluorescence quantitative PCR; Mechanism of action 　　中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.014
　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas Areuginas，PA）是医院感染最常见的病原菌之一，尤以肺部感染最多见。PA耐药形势严峻，1996—2010年耐药PA感染所致菌血症患者病死率由16%升至26%，耐药PA感染已成为院内感染死亡的主因之一[1-3]。PA因其自身结构的特殊性，对多数抗菌药物天然耐药或获得性耐药[4]，且耐药机制复杂[5]，同时由于临床抗菌药物的不合理使用，细菌耐药逐年增加，耐药机制不断变化，因此该菌引发的感染性疾病治疗难度不断增加。通过依据不同耐药机制来寻找或探索相应的抗菌药物已滞后于临床需求，难以及时应用于临床而起到预期的抗菌作用。据NHSN报道，细菌耐药性的增加明显限制了抗菌药物的选择，在过去20年已加速了抗菌药物的研发，但针对耐药PA感染，目前并无疗效更好的药物问世。因此，研发新的高效且低不良反应的药物迫在眉睫。
　　本课题组在“十一五”国家科技支撑计划项目证实，扶正解毒化瘀方在老年性肺炎的治疗中，该方较单纯应用抗生素能够显著改善病程达2周以上患者的呼吸道症状，促进炎性反应病灶的吸收，提高病程较长老年患者耐药菌肺炎的临床有效率[6]。经初步分析，扶正解毒化瘀方的疗效机制可能与干预PA耐药的相关环节从而逆转PA的耐药性，或与抗生素起到协同抑菌增效作用有关。外排泵系统是PA固有耐药的主要机制，其中MexAB-OprM是最常见的药物外排系统。本研究将通过观察扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌（MDRPA）的MexAB-OprM外排泵表达的影响，深入探索该复方的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌株 实验菌株由北京中医药大学东直门医院检验科细菌室提供。在从临床诊断为MDRPA感染所致肺炎患者深部呼吸道分泌物标本中分离、培养、纯化、鉴定所得的18株MDRPA的菌株中（编号为P1～P18），利用碳酰-氰-间氯苯腙（CCCP）筛选出MexAB-OprM高表达株P17，-80 ℃冰箱保存备用。质控菌株为ATCC27853。
　　1.1.2 藥物 扶正解毒化瘀方：黄芩、连翘、漏芦、赤芍、瓜蒌、西洋参、败酱草、炒薏苡仁等组成。药物剂型为北京康仁堂药业有限公司制备的全有效成分提取配方颗粒。沸水溶解，用0.22 μm过滤器过滤，4 ℃冰箱低温保存备用。哌拉西林/他唑巴坦（TZP，Wyeth Lederle S.R.L.，产品批号：AKGD/11）购自北京中医药大学东直门医院西药库。
　　1.1.3 试剂与仪器 营养肉汤（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，OXOID CM1168，批号1377374），RNAzol RT、RNAprep Pure总提取试剂盒（天根），逆转录试剂盒（DBI）;荧光定量PCR检测试剂盒（Genecopies），DEPC（Vetec）。采用BD Phoenix-100 system全自动细菌分析仪（美国BD公司，型号BD Phoenix），恒温湿培养箱（上海一恒科技仪器有限公司，型号LHS-250 HC-11），恒温震荡器（苏州培英实验设备有限公司，型号MSG.N 180L），台式高速离心机（D3204R SCIlogex），荧光定量PCR仪（7500，ABI），微量核酸定量仪（Merinton，SMA4000）;基因扩增仪（Stratagene Mx3000P）。
　　1.1.4 引物设计 委托上海生物工程有限公司合成序列。目的基因mexB片断长度为130 bp，上游引物：5′-TCGAGGAGATCGTCAAGCAA-3′，下游引物：5′-CAGAGGAACACCACCAGCAG-3′。目的基因oprM片断长度为114 bp，上游引物：5′-ACGCGAAGATCCAGAAGGAC-3′，下游引物：5′-GCAACTGCTCGGTGAAGGTA-3′。目的基因mexR片断长度为142 bp，上游引物：5′-GCAGCTTCCAGCTCTTCCTC-3′，下游引物：5′-CACTGGTCGAGGAGATGCAC-3′。内参基因rpsL片断长度为99 bp，上游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′，下游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′。
　　1.2 方法
　　1.2.1 TZP最小抑菌浓度（MIC）测定 利用微量稀释法，在96孔板1～10孔中加入100 μL肉汤，第1孔加入配置好的含有4 096 μg/mL TZP的肉汤100 μL，将TZP进行对倍稀释;再往12、13孔加入200 μL肉汤分别作为阳性和阴性对照;配制菌液，分别往1～11孔中加入已调制好的菌液10 μL，最终接种菌量约为5×105 CFU/mL，重复3行。
　　上述96孔板振荡培养18～24 h，放入酶标仪中检测，参数调整为single，570 nm，读出相应的OD值。MIC判定标准：抑菌率（%）=（阳性对照OD值-试验OD值）/（阳性对照OD值-阴性对照OD值）×100≥80%。
　　1.2.2 扶正解毒化瘀方最小杀菌浓度（MBC）测定  微量稀释法将中药水提物对倍稀释成10个梯度，第1孔浓度为1.56 g/mL，11孔为阳性对照，12孔为阴性对照;配制菌液，往1～11孔中加入已调制好的菌液10 μL，最终接种菌量约为5×105 CFU/mL，重复3行。
　　上述96孔板振荡培养18～24 h。实验结果判定：接种环挑取96孔板中1～10孔内菌液涂至增菌培养基血平板上，37 ℃恒温湿培养箱静置培养18～24 h观察结果。培养出3个菌落以内的浓度为中药水提物的最小杀菌浓度。 　　1.2.3 生长曲线测定 取4支50 mL无菌离心管，每只离心管中加入30 mL肉汤，于1、2、3管内加入上述实验中配置的菌液1.5 mL（菌液终浓度为5×105 CFU/mL），前三管为平行实验组，第4管不加菌，为阴性对照组。将离心管放置于恒温震荡器中进行震荡培养，温度37 ℃，转速200 r/min。在菌液震荡培养的0～24 h中，每隔1 h使用酶标仪测定菌液的OD570nm值，对OD570nm值用统计软件进行分析，绘制标准生长曲线，确定PCR实验中所需MDRPA菌株样本的最佳培养时间。
　　1.2.4 实时荧光定量PCR分离提取总RNA 1）培养细菌：挑取单个细菌菌落分别置于含TZP、中药水提物的营养肉汤及纯营养肉汤中，37 ℃过夜振荡（200 r/min）培养，收集5 mL含菌培养液，10 000 r/min离心1 min，尽量吸净上清。往沉淀中加入1 mLRNAzol RT，反复吹打裂解细胞，裂解液转移至2 mL离心管中。2）相分离：每1 mLRNAzol RT加入400 mL ddH2O，盖上盖子，振荡混匀约15 s，室温静置5～15 min。10 000 r/min离心15 min。3）沉淀：转移上清至新的2 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10 min。10 000 r/min离心10 min。4）洗涤弃上清，余下沉淀加入400 μL 75%乙醇，混匀后7 500 r/min离心1～3 min，此步重复1次。5）溶解：弃上清，自然风干沉淀，加入50 μL ddH2O溶解，即为总RNA。
　　逆转录反应：取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μLoligo（dT）15，用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μL，于PCR仪上70 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却，依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反转录酶，用枪抽吸混匀。于PCR仪上42 ℃保温30 min，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶。
　　定量PCR反应：使用All in one qPCR Mix进行定量PCR反应。取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系：2×All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，PCR forward primer（2 μmol/L）2.0 μL，PCR reverse primer（2 μmol/L）2.0 μL，cDNA 2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR擴增反应条件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，共进行40个循环。循环结束后从55 ℃升高到95 ℃获取熔解曲线。根据标准品反应后所得数值获得标准曲线，目的基因的反应则根据标准曲线进行定量分析。目的基因初始模板量与内参基因初始模板量的比值，为所测目的基因的相对表达量。
　　1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，方差齐采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比较采用LSD法;方差不齐采用Welch近似方差分析，多重比较采用Dunnett′S T3法。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 微量稀释法测定TZP的MIC值 根据抑菌率≥80%的MIC判定标准得出，P17和ATCC27853菌株TZP的MIC值分别为1 024 μg/mL和2 μg/mL。参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准[7]，MIC≤16 μg/mL即为敏感，ATCC27853 MIC值可以验证实验方案的可行性，实验菌株P17对TZP耐药。
　　2.2 微量稀释法测定中药水提物的MBC值 将96孔板中1～10孔内菌液接种于血平板上，37 ℃恒温湿培养箱静置培养18～24 h，结果显示只有初始浓度的孔未培养出菌落，最终确定扶正解毒化瘀方水提物的MBC值为0.78 g/mL。
　　2.3 绘制多重耐药铜绿假单胞菌的标准生长曲线  酶标仪测得培养24 h的MDRPA实验管及阴性对照管的OD570nm值。见表1。
　　OD570nm值反应菌液的浓度，OD570nm值越大菌液浓度越大，细菌生长数量越多。由上表可见在24 h内随着培养时间的增加细菌OD570nm值逐渐增大，说明培养剂中的MDRPA生长、繁殖菌量逐渐增多。以培养时间为横坐标，OD570nm值为纵坐标，绘制实验菌株P17的标准生长曲线。结果提示，在0～6 h细菌进入新的营养环境的适应阶段，细菌分裂很少，细菌数量增加不明显，为迟缓期，此阶段为细菌下一阶段的分裂增殖做准备。在6～21 h进入细菌的快速分裂增值增殖阶段，以指数方式增加，为指数增长期。21 h后随着培养基中营养物质的消耗，代谢产物的累积，细菌的增殖和死亡达到平衡，细菌量维持在一定水平，进入平稳期。细菌在指数增长期基因复制处于较高水平，因此实验菌株P17在进行实时荧光定量PCR实验时，最佳的菌株样本制备时间为18～21 h。见图1。
　　2.4 实时荧光定量PCR测定扶正解毒化瘀方对MexAB-OprM外排泵表达的影响 根据预实验结果，实时荧光定量PCR菌株样本制备的营养基中TZP组TZP的浓度为1/32MIC值，即32 μg/mL;扶正解毒化瘀方水提物的浓度为1/4MBC值，即0.195 g/mL。单纯营养肉汤培养的菌株样本作为空白对照组。空白对照组、TZP组、扶正解毒化瘀方水提物组mexB、oprM、mexR的表达量之间差异均有统计学意义（P<0.05）。扶正解毒化瘀方水提物干预组mexB、oprM的表达量较空白组降低，TZP组较空白组增高。经TZP干预组和扶正解毒化瘀方水提物干预组mexR表达量均高于空白组，TZP干预组较扶正解毒化瘀方水提物干预组升高明显。见表2。 　　3 讨论
　　主动外排系统的过度表达是PA固有耐药的重要原因之一。1993年，首次报道PA外排泵的表达。许多革兰氏阴性杆菌均有外排泵，PA外排泵是一种质子泵，可将多种药物泵出细胞并参从而产生多重耐药[8]。根据PA全基因组序列分析，推测该菌至少有12种主动外排系统，至今已经通过基因检测发现了7种[9]。MexAB-OprM是在PA中发现的最主要的外排系统，也是临床上最常见的药物外排系统。MexAB-OprM具有最广的底物特异性，包括β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、新生霉素类、磺胺类及甲氧苄氨嘧啶，可导致野生型PA对上述药物耐药[10]。目前研究[11-14]表明，MexAB-OprM是惟一的确定存在于野生型PA中的外排蛋白，对其天生的耐药性起重要作用而MexAB-OprM的失活可恢复野生型PA对多种抗菌药物的敏感性。MexAB-OprM由MexAB-OprM操纵子mexO编码，mexR、nalC、nalD基因可负性调节操纵子mexO的表达，使mexR基因突变失活。mexB和oprM基因位于同一个操纵子，mexR是MexAB-OprM操纵子的上游基因序列，控制产生MexAB-OprM的阻遏蛋白MexR[15]，mexR的表达量增加，则会抑制MexAB-OprM外排泵基因的表达。
　　尽管抗菌药物的使用目前仍然是临床上治疗耐药菌感染最为常用的手段，但由于PA耐药机制复杂，抗生素的选择压力逐年增加。中医药是一个伟大的宝库，对于感染性疾病的治疗具有丰富的理论和临床实践基础。近年来中药治疗耐药菌感染的研究进展较快，取得了较为积极的成果。林冬玲[16]等发现加味银翘散可通过降低PA外膜蛋白OprD2的表达而减弱其耐药性。李少滨等[17]证实黄芩苷能够体外抑制PA生物膜的形成，从而降低PA的耐药性。
　　王淋荆等[18]发现中药穿心莲、金银花、夏枯草和五倍子可通过促进外排泵基因的表达拮抗抗生素的抗菌作用。
　　本课题组在临床研究疗效肯定的基础上，选用MDRPA最为重要的外排泵耐药机制为切入点，对扶正解毒化瘀方延缓或逆转MDRPA耐药性的相关机理进行深入研究。利用泵抑制剂和PCR法筛选出MexAB-OprM外排泵阳性的菌株，并对其用TZP和扶正解毒化瘀方水提物进行干预培养。实时荧光定量PCR检测结果显示，扶正解毒化瘀方水提物干预后oprM的表达量降低（P<0.05），mexB表達量显著降低（P<0.05），mexR表达量明显高于空白组（P<0.05），表明扶正解毒化瘀方治疗MDRPA感染所致肺炎的有效性可能是通过直接和间接抑制MexAB-OprM外排泵的表达，降低细菌耐药实现的。TZP作为半合成青霉素与β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂，除其本身杀菌作用外，还可以通过促进产生阻遏蛋白MexR，而抑制MexAB-OprM外排泵基因的表达，从而降低细菌耐药性。
　　近年来对中药抑菌作用的研究涉及到体外研究与体内研究。体外研究多从单味中药或中药复方对细菌的直接抑菌作用入手探讨中药的抑菌机制。但综合分析目前中药的体外抑菌研究，未能得出令人满意的结果。并且，在组方用药方面，目前的体外实验用药多局限于清热解毒类药物，较少涉及含有扶正类药物的中药复方。因此，进一步的研究，应在传统中医理论的指导下，辨病与辨证相结合，更加重视耐药菌感染肺炎病机中正气不足的因素，采用更为切合病机的中药复方进行干预，深入挖掘中药在直接抑菌、逆转PA耐药及与抗生素协同抑菌等方面的作用机制和巨大潜力，从而多角度、多层面探索中医药对于耐药菌感染性疾病的疗效机制。
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