绿僵菌侵染对黏虫免疫反应的影响

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　　摘要为揭示黏虫被病原菌侵染后的免疫应答机制，本试验分析比较了黏虫幼虫被金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliae侵染后不同时间其血淋巴蛋白含量、免疫关键酶系（酚氧化酶PO，溶菌酶）活性、抗菌活力以及血细胞数量等免疫相关指标的变化。结果表明：受绿僵菌侵染后，黏虫6龄幼虫血淋巴蛋白含量在侵染初期（6h和24h）显著高于对照，侵染48、72和96h后幼虫血淋巴蛋白质含量显著低于对照。且侵染后幼虫血淋巴PO活性也呈现先升高后降低的趋势，侵染初期（6h和24h）显著高于对照，侵染后期除72h外与对照组无显著差异。侵染初期（24h）溶茵酶活性也显著升高，随后出现下降，并于48h显著低于对照，但在化蛹时（96h）再次上升。绿僵菌侵染后期，黏虫的抗菌活性下降，于侵染后72h抗菌活性显著低于对照，而侵染初期抗菌活性与对照无显著差异。另外，绿僵茵侵染对幼虫血细胞数量以及浆血胞比率也有显著的影响，表现为：侵染后6h和24h血细胞总数、浆血胞比率均显著高于对照，随后与对照并无显著差异。综上，绿僵茵侵染黏虫幼虫初期会显著诱导其免疫反应的启动，体现在主要免疫指标升高，而后随着免疫系统的破坏与能量的消耗，其免疫反应能力降低，生理活动受到干扰。
　　关键词黏虫;金龟子绿僵菌;免疫反应
　　中图分类号：S476.12文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2017132
　　昆虫在繁衍过程中会因为种种原因受到外界天敌寄生或病原物侵染，其正常的生长发育受到严重影响。而昆虫能在各种不同的外界环境中生存，与其自身的免疫反应有重要的关系。昆虫作为无脊椎动物，免疫系统以先天性免疫为主。与高等动物相比，昆虫体内缺乏更高等级的免疫球蛋白等免疫物质，但在长期的进化过程中发展出一套独特的防御系统来阻止外来生物的侵入。除坚硬的表皮、组织外，昆虫血淋巴系统在免疫机制中也承担着重要的作用，其中主要包括体液免疫和细胞免疫两大系统。当昆虫受到外源病原物的刺激时，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）可以参与昆虫表皮的硬化和黑化，从而支撑和保护虫体正常的生长发育;而当病原物进入虫体后，溶菌酶可以导致病原体细胞壁破裂并使内容物逸出，最终病原细胞破裂死亡;抗菌肽是昆虫被病原菌感染后，虫体内快速产生的一种免疫诱导分子，对外源病原物具有强有力的杀伤作用;血淋巴细胞是昆虫细胞免疫的主要执行者，血细胞的种类和数量是细胞免疫反应的重要指标，免疫血细胞可对外源异物进行吞噬、形成结节、包被和血凝等，从而参与伤口的愈合、凝结、合成及分泌免疫相关因子。因此，PO活性、溶菌酶活性、抗菌活力和免疫血细胞数量等免疫指标的变化是昆虫免疫反应的标志性参数。这些免疫反应同时也会影响昆虫的资源分配并可能改变其行为或发育方向，从而影响种群动态。
　　黏虫Mythimna separata（Walker）是一种典型的季节性远距离迁飞害虫，是严重威胁我国主要粮食作物生产安全的重大害虫。黏虫发生范围广，为害世代多，除2012年和2013年连续在全国大发生外，近年来，在我国局部地区同样暴发成灾。而在全国开展的黏虫为害调查显示，幼虫表皮发生黑化可作为成灾种群典型的预警信息。黑化幼虫抵抗天敌和病原物入侵的能力明显增强，一些常用的生物制剂对其防治效果不明显。研究发现，黏虫幼虫黑化是一种典型的密度依赖型现象，黑化幼虫适应能力的增强主要体现在取食量大、抗逆能力增加和由其发育而来的成虫迁飞能力提高等方面，从而导致生产上为害更加严重。近年研究也发现高密度饲养的幼虫表皮黑化程度明显高于单头饲养的黏虫，较高密度饲养的黏虫（10头/瓶）抵抗伞裙追寄蝇Exorista civilis Rondani的寄生和绿僵菌侵染的能力明显增加，其6龄幼虫表皮和血淋巴酚氧化酶（PO）的活性也显著高于单头饲养的黏虫，这些结果初步明确了PO活性的增加是高密度幼虫黑化及抗病能力提高的关键因素。然而，目前对黑化黏虫的研究多集中在生长发育和行为变化方面，关于黑化黏虫防御的免疫应答机制方面还未有报道。因此，本研究旨在通过绿僵菌侵染黑化黏虫6龄幼虫后测定其血淋巴蛋白质含量、PO活性、溶菌酶活性、抗菌物质和血细胞数量等免疫指标的变化，揭示黑化黏虫的相关免疫反应，从而对指导和发展其生物防治提供重要数据。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　供试菌株：金龟子绿僵菌Metarhizium aniso-pliae（Metch.）Sor购自神威生物公司。
　　供试昆虫及饲养：在吉林采集的高龄黏虫，在实验室繁殖6代。在饲养密度为10头/瓶（直径9cm×高13cm）条件下诱导出的黑化型黏虫。幼虫饲养参照吕伟祥等室内人工饲养方法，培养温度为（23-1-1）℃，光周期为L∥D=14h∥10h，湿度为70%～80%，饲料为30～50cm高的新鲜玉米苗，每日更换饲料，直至幼虫老熟为止。幼虫老熟时瓶中加入含水量10%～15%的土壤供其化蛹和羽化。
　　1.2方法
　　1.2.1绿僵菌侵染方法
　　根据白毓昕的试验结果，106cfu/mL的孢子浓度可以激活黏虫6龄幼虫免疫反应且幼虫不会迅速死亡，故本试验接种用孢子悬浮液浓度设为106cfu/mL。用含0.01%吐温-80的无菌水配制该浓度的绿僵菌分生孢子悬浮液，将蜕皮24h以内的黏虫6龄幼虫浸于孢子悬浮液中5s后取出，放在吸水纸上吸干虫体表面水分，然后将其置于盛有新鲜玉米叶的养虫瓶中按1.1的方法继续饲养，以含0.01%吐温80的无菌水浸泡虫体为对照。处理后每天更换新鲜叶片，去除死亡幼虫。每个处理重复3瓶，共30头。
　　3讨论
　　昆虫体内含有多种蛋白质，这些蛋白质不仅在昆虫组织形成、物质代谢的过程中起着重要作用，同时与虫体生长发育的激素调控及免疫应答机制等方面也有着密切的联系。昆虫蛋白通过调节机体特异性和非特异性免疫功能，发挥其增强免疫的作用，从而提高虫体对外界刺激的抵御能力。本研究结果表明，黑化黏虫被侵染后，血淋巴蛋白含量出现显著的变化，表明绿僵菌的入侵刺激黑化黏虫产生防御反应，诱导脂肪体中蛋白质的合成与分泌发生变化;同时在侵染初期蛋白含量显著增加，推测此时黏虫幼虫初始接受到外源刺激，产生相关的免疫反应来抵抗绿僵菌的侵染，表现为蛋白质含量明显增加;之后随着免疫反應的趋缓与免疫能量的消耗，虫体内蛋白质含量开始减少。 　　PO是昆虫体液免疫中及其重要的免疫防卫因子，酚氧化酶可以催化酪氨酸产生多巴，多巴氧化为醌并最终产生黑色素。当外源生物入侵时通过特异性级联反应而活化，产生黑化反应来提高昆虫的抵抗能力。试验中PO的活性随着日龄的增加而下降，与小菜蛾幼虫受小菜蛾颗粒体病毒PlXyGV感染后PO活性的变化规律相同;绿僵菌侵染后，幼虫PO活性也发生显著变化，表明幼虫免疫水平的改变。绿僵菌侵染初期PO活性增强显著，且在这个时期，幼虫蜕皮后表皮开始逐渐变黑，较高的PO活性有助于虫体防御能力的提高，同时PO介导的黑化作用来帮助幼虫抵抗绿僵菌的侵染，并且在病原物刺激的初始阶段，是虫体内部免疫反应最活跃时期。
　　溶菌酶来源于昆虫的脂肪体，释放到血淋巴中。昆虫处于不正常生理状态下时，血淋巴中的溶菌酶的活性会产生极大变化。感染、出血、受傷以及各种环境压力下，都能使溶菌酶的数量急剧增加。之后随着免疫反应的进行，其免疫能力的消耗会导致溶菌酶活性的减少，本试验中所得结果与许红兵等相似，但在侵染后96h，与对照组相比，其溶菌酶活性再次升高，这可能由于幼虫即将化蛹的原因，黏虫对外界刺激更加敏感，诱导宿主的免疫反应来协助化蛹的进行。绿僵菌侵染后，黏虫血淋巴中抗菌活性物质开始生成，其抗菌活力先增加后趋缓，与PO活性、溶菌酶等免疫指标的变化趋势有所不同，这些结果表明昆虫免疫功能之问很可能存在着相互平衡，在受到外界胁迫时，可以将有限的能量进行合理分配，从而最大化地有利于虫体正常生长发育。
　　本试验中绿僵菌侵染后黏虫幼虫血细胞总数目和免疫血细胞数目与比率均有不同程度的提升，与邓日强等用核多角体病毒SpltMNPV感染斜纹夜蛾幼虫后血细胞总数目、比率变化相同，初步表明了虫体内细胞免疫过程的发生，而相关免疫过程如吞噬作用、形成结节、包被等免疫行为还需要进一步的研究。粒血胞和浆血胞是参与细胞免疫应答最相关的两种细胞，侵染后黏虫幼虫粒血胞和浆血胞数量和比率的增加是幼虫群体抵抗外源刺激物的适应性特征，与幼虫免疫能力的提升密切相关。
　　综上所述，对黏虫各免疫指标的分析表明，绿僵菌侵染对黏虫6龄幼虫的蛋白含量、免疫酶活性、血细胞数量等生理指标有显著影响。黏虫幼虫在受到侵染后，虫体会通过体液免疫和细胞免疫的共同作用而产生防御反应。本文对黏虫防御行为免疫应答问的关系提供了一定的理论依据，对揭示黏虫抵抗病原物侵染的能力、机理及黏虫成灾机制具有重要意义。
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