铁观音茶梗中挥发性物质分析

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　　摘  要  本研究以铁观音茶梗为供试材料，采用顶空进样法-气质联用（HS-GC/MS）技术对其挥发性物质进行提取和检测，利用质谱结合保留指数对其进行定性，并对挥发物种类、相对含量及部分挥发物所具备的生物活性进行比较和探讨。结果表明：从安溪铁观音茶梗中共检测出130种化合物， 其中共有的成分108种;采用质谱法（mass spectrometry， MS）完全鉴定出45种、初步鉴定出58种，采用各化合物的保留指数（retention index，RI）鉴定出54种;MS与RI相结合共完全鉴定出68种挥发物。这表明谱库检索与保留指数相结合，有利于提高可定性挥发物的数量以及定性的准确度。在梗中，碳氢类化合物、醛、醇、酯的种类和含量都最为丰富，相对含量高于1%的挥发物有24种，部分挥发物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用，其含量占茶梗挥发物总含量的20.51%。该结果为研究茶梗在形成乌龙茶香气品质中所起的作用及茶梗的综合利用提供理论基礎。
　　关键词  安溪铁观音;茶梗;HS-GC/MS;挥发物;生物活性
　　中图分类号  S571.1      文献标识码  A
　　Abstract  The tea stem of Anxi Guanyin was taken as the research object and the volatile substances of stem were extracted and analyzed by headspace sampling-gas chromatography/mass spectrometry （HS-GC/MS）. Its qualitative analysis was achieved by mass Spectrometry （MS） combined with retention index （RI）. The type and relative content of the volatiles and the biological activity of some volatiles were compared and discussed. 130 compounds were detected in the tea stem of Anxi Guanyin， of which 108 were in common. 45 compounds were totally identified and 58 compounds were preliminarily identified by MS， while 54 compounds were identified by RI. 68 compounds were totally identified by MS combined with RI， meaning the combination of MS and RI greatly improved the quantity of qualitative volatiles and accuracy of quality. The types and contents of hydrocarbons， aldehydes， alcohols and esters were the most abundant in the stem. There were 24 volatiles with relative content higher than 1%. Some volatiles， whose content accounted for 20.51% of the total volatile content of tea stem， had biological activities， such as anaesthesia， bacteriostasis， anticancer and et al. The study would provide a theoretical basis for the role of the tea stem in the formation of aroma quality of Oolong tea and the comprehensive utilization of tea stems.
　　Keywords  Anxi Guanyin tea; tea stem; HS-GC/MS; volatiles; biological activity
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.019
　　制作乌龙茶的鲜叶要求具有一定的成熟度，因而茶青中不仅有叶片，还含有较多的梗。茶梗是一种特殊的可再生生物资源[1]，尽管含有相当数量的香气物质，但由于茶梗影响茶叶的美观，同时其茶碱含量偏高，口味较为苦涩，因此，往往被拣出。茶叶加工每年都有大量的茶梗副产品，约占毛茶总重的20%，如果能合理利用，可增加茶叶生产过程的经济效益[2-3]。
　　茶梗与茶叶所含的芳香性物质和抗氧化性物质的组成相似。芳香物质不仅影响茶叶的品质，而且也影响茶树本身及被饮用者的生理代谢。前人研究发现香气可以调节精神状态，具有抗菌[4]、镇静[5]、止痛[6]、消炎[7]、抗抑郁抗焦虑[8-9]、抗疲劳[10]等作用。因此，茶梗中的挥发性物质可以作为天然的食品添加剂、药用保健成分、化妆品原料等，从而提高茶产品的附加值。
　　目前已有学者对茶梗的挥发性物质进行了研究。谢清桃等[1]采用同时蒸馏萃取法提取铁观音茶梗浸膏挥发性成分，用GC/MS法分离鉴定出58种挥发性成分，并将浸膏用于卷烟加香，能够明显丰富烟香，减小刺激性和改善卷烟余味。袁杰[11]采用SPME-GC/MS对茶梗的香气和铁观音香气的生物活性等进行了研究。Zeng等[12]对干燥乌龙茶样及其茶汤的挥发物和糖苷类前体进行感官审评和生化研究，结果表明，梗中茶氨酸和挥发性单萜的积累量比叶子中更加丰富，但茉莉内酯、吲哚和反式橙花醇含量比叶子中少，梗的存在没有显著改善茶样总的香气特征。 　　铁观音作为闽南乌龙茶的代表，其毛茶含有较多的梗，是研究茶梗挥发物很好的实验材料。本试验从安溪不同产地收集了铁观音毛茶，以其梗作为研究对象，采用顶空进样法-气质联用（HS-GC/MS）技术对茶梗挥发物进行提取和检测，对其种类、相对含量及其相关的生物活性进行了统计分析，以期为研究茶梗在形成乌龙茶香气品质中所起的作用及茶梗的综合利用提供理论基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  茶样  选取2017年秋季安溪铁观音毛茶样6个，以其梗作为试验样并磨碎，过40目筛，装于铝箔袋，密封备用。
　　1.1.2  主要试剂  NaCl（分析纯，≥99.5%，上海国药集团化学试剂有限公司），正构烷烃混合标准品C8-C30（美国o2si公司）。
　　1.1.3  主要仪器设备  Clarus SQ8T 型气质联用仪、Elite-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TurboMatrix 40 Trap自动顶空进样器、20 mL顶空瓶（美国Perkin Elmer公司）;电子分析天平（0.0001 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;WK-400B高速药物粉碎机（山东青州市精诚机械有限公司）;实验室超纯水器（科尔顿水务有限公司）。
　　1.2  方法
　　按课题组前期优化的试验参数进行操作[13]。
　　1.2.1  茶样顶空进样方法  每个茶梗样设置3个平行，准确称取0.5 g的茶梗粉（精确至0.0001 g）于20 mL顶空瓶中，加入1 mL的溶于三级水的饱和NaCl溶液，用配有聚四氟乙烯垫的密封盖密封并按顺序放入自动进样器，以设置好的仪器参数进样。炉温（平衡温度）80 ℃，取样针温度100 ℃，传输线温度120 ℃，样品平衡时间60 min，捕集阱Hi 280 ℃，Lo 40 ℃，保持5 min，干吹1 min，解析0.5 min，顶空瓶压力40 psi，色谱柱压力12 psi，解析压力15 psi，顶空出口分流。
　　1.2.2  GC-MS条件  升温程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至125 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。载气为高纯度 He（99.999%）。电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV;离子源温度230 ℃，质谱传输线温度250 ℃，质量扫描范围m/z 45～500。
　　1.2.3  正构烷烃顶空进样方法与保留指数计算  准确移取2 μL正构烷烃混合标准品，按与茶梗样相同的顶空和GC-MS条件进样，重复3次。记录每个正构烷烃标准品的出峰时间，求3次重复的平均值。茶梗挥发物各组分的保留指数计算采用Kovats保留指数计算公式[14]：
　　式中：RI—待测组分的保留指数;RTunknown—待测组分的保留时间;RTn、RTn+1—待测组分前后正构烷烃的保留时间。
　　1.3  数据分析
　　通过检索NIST 2011在线质谱数据库，核对质谱匹配度并参考相关文献资料[15-22]，然后再从特征离子、实际成分、保留指数等方面，分别对各峰所代表的挥发性物质的化学结构和名称加以确认。其相对含量采用峰面积归一法分析，即以各香气组分的峰面积占总峰面积之比值表示组分相对含量。
　　采用SPSS 21软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）。
　　2  结果与分析
　　2.1  安溪铁观音茶梗挥发性成分的定性与定量分析
　　由表1可知，安溪铁观音茶梗检测出来的挥发物总峰面积范围为365 160 457～396 236 061，平均值为355 260 803，峰个数范围为115～125，平均值为121.67。
　　由表2可知，安溪铁观音茶梗中共检测出130种挥发性物质，其中MS完全鉴定出45种，初步鉴定出58种，RI鉴定出54种，MS与RI相结合共完全鉴定出68种挥发物。
　　6个样品共有的芳香物质合计108种，包括碳氢類化合物（33种，12.72%）、未知（22种，9.17%）、醛（14种，17.63%）、醇（10种，14.25%）、酯（6种，12.95%）、含氮化合物（5种，6.14%）、氯化物（5种，11.32%）、酮（5种，2.22%）、杂氧类（5种，7.49%）、酚（2种，0.31%）、含硫化合物（1种，2.94%）。可以看出，在梗中碳氢类化合物、醛、醇、酯不管是种类还是含量都最为丰富。茶梗挥发物中相对含量高于1%的化合物有24种，其相对含量与香气类型统计结果见表3。
　　2.2  安溪铁观音茶梗中具有生物活性的挥发性成分
　　茶梗中检测出来的部分挥发物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性，可以直接作为药物或者制备药物的原料、中间体而应用于医学领域。经过检索前人文献，在茶梗所含的108种共有成分中，除了20种未知化合物及部分检索不到医药相关理化性质和生物活性的化合物外，课题组对剩下的茶梗挥发物进行了功能分类以及种类、相对含量的统计，详见表4。
　　其中茶梗中具麻醉作用的挥发物包括一氯甲烷（7.77%）、2-甲基呋喃（0.57%）和β-石竹烯（0.02%）;具抑菌、抗病毒活性的挥发物有吲哚（0.79%）、D -柠檬烯（0.43%）、姜黄烯（0.0.3%）和β-石竹烯（0.0.2%）。活性氧自由基能够引发癌症、自身免疫性疾病、炎症、肿瘤、心肌与脑损伤等性
　　能已被生物医学界所证实， 因此抗氧化活性与抗癌活性密切相关[23]。茶梗中具有抗癌、抗氧化活性的挥发物有吲哚（0.79%）、D-柠檬烯（0.43%）、水杨酸甲酯（0.09%）、姜黄烯（0.03%）、β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有消炎抗炎活性的挥发物有γ-雪松烯（0.75%）、D-柠檬烯（0.43%）、甲基丁香酚（0.20%）、水杨酸甲酯（0.09%）、姜黄烯（0.03%）和β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有抗抑郁活性的挥发物有顺式-β-罗勒烯（1.77%）和β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有镇痛活性的挥发物有水杨酸甲酯（0.09%）。茶梗中具有止咳祛痰活性的挥发物有D-柠檬烯（0.43%）、甲基丁香酚（0.20%）、愈创木酚（0.09%）、姜黄烯（0.03%）和β-石竹烯（0.02%）。在茶梗中具有镇静、抗焦虑、安眠作用的挥发物有甲基丁香酚（0.20%）、正己醇（0.14%）、β-石竹烯（0.02%）。在茶梗中不少挥发物可用作制备医药的原料或者中间体。包括异戊醛（2.11%）、苯甲醛（1.71%）、庚醛（1.38%）、甲基庚烯酮（1.18%）、吲哚（0.79%）、苯乙醛（0.63%）、2-甲基呋喃（0.57%）、苯乙腈（0.29%）、对二甲苯（0.25%）、顺式-4-庚烯醛（0.17%）、正己醇（0.14%）、α-松油烯（0.11%）和愈创木酚（0.09%）。 　　可见，在茶梗中有22种具有生物活性的挥发物，且不少挥发物同时兼备多种生物活性，比如D-柠檬烯具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎抗炎、止咳祛痰等一系列生物活性。这些挥发物的含量之和占茶梗挥发物总含量的18.90%～ 22.93%，平均值为20.51%。
　　3  讨论
　　本研究从铁观音茶梗中共检测出130种挥发性物质，MS与RI相结合完全鉴定出68种挥发物，效果优于使用单一的定性方法，因此谱库检索结合保留指数的定性方法可大大提高定性准确度和可定性物质数量。同时，因为保留指数反映的是化合物与固定相的相互作用，当固定相相同时，这种相互作用仅与化合物的拓扑、几何和电性特征相关[24-25]，因此本研究定性结果可用于与相同实验条件下的实验结果进行比对。
　　经过比对前人文献，本研究茶梗中检测到的与铁观音成品茶相同的香气成分有醋酸乙酯（6）、正己醛（18）、庚醛（35）等40种（表2中有下划线的物质）[19， 26-29]。铁观音茶梗中检测出的挥发物与铁观音成品茶具有相似性，这是由乌龙茶的鲜叶原料要求和加工工艺所共同决定的。制作乌龙茶的鲜叶要求具有一定的成熟度并含有一定量的梗。做青是乌龙茶的特征性工艺也是形成乌龙茶品质特征的关键技术，做青包括摇青与晾青，其作用分别是走水、还阳。乌龙茶香气成分转化和形成的重要条件和显著特征之一是，具有一定成熟度的鲜叶在长时间做青过程中使得叶片主要在叶缘损伤变色，逐步适度失水，嫩茎中的内含物通过“走水”输送至叶细胞以增进香气的形成，保证内含物转移和转化的节奏。因此梗的存在對乌龙茶香气品质特征的形成是必须的。与茶梗中检测到的相同成分有9种，包括正己醛（1）、苯甲醛（46）、D-柠檬烯（60）、苯乙醛（65）、顺式-β-罗勒烯（66）、苯乙腈（82）、水杨酸甲酯（95）、吲哚（106）、β-紫罗兰酮（124）[1]。部分在前人文献中检测到的梗所含有的香气成分本研究没有检测出，此外本研究检测出了一些前人文献中没有检测到的挥发物，这可能是因为所选茶样产地不同、检测方法与条件不同以及质谱定性能力强弱不同导致的差异。
　　在铁观音茶梗中，碳氢类化合物、醛、醇、酯不管是种类还是含量都最为丰富，其中碳氢类化合物中的不饱和烃往往具有独特的香型，在茶梗整体香型中所起作用更大，比如D-柠檬烯具有柠檬香，α-柏木烯具木香。醛类化合物阈值很低，对产品的风味贡献较大[30]。醇类通常具有芳香或酸败气味，其中，不饱和醇的风味阈值较低，对风味贡献较大，如多种萜醇和芳香醇[31]。酯类化合物通常呈现水果香味[32];有的酯类成分，如油酸甲酯、亚油酸甲酯等，它们由高级脂肪酸和低级醇脱水缩合而成，没有气味，对茶叶香气形成几乎没有作用[28]。此外，梗挥发物共有成分中相对含量高于1%的化合物包括醋酸乙酯、一氯甲烷、1-戊烯-3-醇等24种，它们大部分具有独特的香型。但是由于各种香气成分对检测器响应校正因子各不相同，供试茶样各类香气成分（如醇、醛、酮等）并不具备成分间含量或类内加和可比性。因此，不同来源茶样某种或某些香气成分含量的增减变化更值关注[33]。此外有些大量香气成分对茶叶香型品质贡献并不很大，其中还存在感管阈值问题[34]。茶叶梗中相对含量大于1%的化学成分列于表3，这些成分虽然不一定是茶梗的特征香气成分，但以相同的步骤检测铁观音成品茶香气成分后，可将梗与成品茶中同一物质的相对含量或含量（以峰面积代表）作比较，不仅可为研究做茶过程中梗与茶之间香气成分的互相转化提供一定的参考，而且梗中这些含量较高的成分，可被提纯应用于医药方面以提高茶梗的附加值。
　　6个茶梗样的共有成分有108种，其中，含量18.90%～22.93%（平均值为20.51%）的挥发物可用于医药，具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用。但由于香气成分总量仅占茶叶干物质总量的0.005%～0.03%，含量极低，这些挥发物发挥麻醉、抑菌、抗癌等活性所需的最低浓度及最适浓度需要后期试验来进一步确定。
　　本研究分析了铁观音茶梗中所含挥发物的种类及相对含量，并统计分析了部分挥发物所具备的的生物活性，经过与前人文献比较分析，初步探究了铁观音茶梗的挥发物。比较梗、纯茶、全茶香气成分与感官审评之间的差异，进一步了解梗在形成乌龙茶香气品质中所起的作用，结合体内和体外生物实验探究茶梗中具生物活性的香气提取物在医药中的作用是接下来的研究方向。
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