淀粉含量对黑曲霉孢子产量、质量的影响
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摘 要：主要论述了麸皮培养基中不同淀粉含量对产黑曲霉孢子的速度、质量、数量的影响。试验结果表明，麸皮培养基中的淀粉含量能够提高黑曲霉菌丝生长速度，但是不利于黑曲霉产孢速度。麸皮培养基中的淀粉含量对麸曲孢子数量及孢子质量没有影响，培养基中的水分及氮源含量，影响黑曲霉孢子的着生，对麸曲孢子总数影响显著。
关 键 词：淀粉;黑曲霉;孢子;质量;产量
中图分类号：TQ 016.1 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）02-0357-04
Abstract： The effect of different starch content in bran medium on the yield， quality and quantity of aspergillus Niger spores was investigated. The results showed that high starch content in bran medium could improve the growth rate of aspergillus niger， but could restrain the sporulation rate of aspergillus niger. The content of starch in the bran medium had no effect on the number and quality of spores， while the content of water and nitrogen in the medium affected the initiation of aspergillus Niger spores and the total number of spores.
Key words： Starch; Aspergillus niger; Spores; Quality; Production
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于该产品具有物理、化学等方面的性能。柠檬酸广泛应用于食品行业，也可应用于医药、电子、化学、石油、皮革、纺织、建筑等各个领域[1，2]。我国是柠檬酸生产大国，截止2018年产量已达177万t，2010-2015年均增长率为2.9%;表观消费量从2010年的104万t增长到2015年的118万t，年均增长率为2.6%，出口占60%。
柠檬酸发酵通常用黑曲霉二级发酵的方式，即先培养大量的成熟孢子，再将成熟的孢子做成孢子悬浮液，接入种子罐培养，种子罐培养合格后再接入发酵罐进行发酵产酸。黑曲霉孢子制备过程比较复杂。合格的黑曲霉菌种需要经过分离、筛选，选育出高产菌株，然后再进行斜面培养，最后再进行三角瓶逐级扩大培养，制备过程繁琐，工作量大，从菌种选育到合格的成熟麸曲，制备周期至少需要30 d以上[1]。
所以黑曲霉孢子质量、产量是保证柠檬酸产量的关键因素。而营养因素对黑曲霉生长和产孢的影響是大规模生产柠檬酸的前提。碳源、氮源、维生素等营养物质是黑曲霉种子生长的所必须的营养物质和能量来源[3]。
作为微生物的营养物质，它能够在细胞外或者直接被水解成小分子物质，通过细胞膜进入细胞，进入细胞后，在胞内酶的作用下，经过化学变化后组成细胞的原生质和细胞结构组成物质，为细胞生命活动提供能量[4]。
麸皮中淀粉含量丰富，淀粉是大多数微生物可以利用的碳源物质，可以为黑曲霉生长提供足够的碳源。通常生产用水淘洗至淀粉含量极低的麸皮作为黑曲霉产孢的培养基。
麸皮作为黑曲霉产孢培养基具有以下几个优势：（1）天然基质，不仅淀粉含量丰富，其他氮源等他营养物质也非常丰富; （2） 麸皮价格低廉，投资少;（3）麸皮作为黑曲霉产孢的载体，表面积大，孢子附着量多，利于增加黑曲霉产孢量。
1 实验部分
试验仪器设备
试验所需的仪器设备见表1所示。
1.2 试验菌种
本试验使用的菌种由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。
1.3 试验原辅材料
糖化酶、玉米粉、麸皮、a-淀粉酶（耐高温）、等材料均由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。
1.4 试验方法
1.4.1 PDA平板制备
取200 g去皮土豆，切成1 cm方块的小丁，加1 000 mL水，水浴锅内煮沸，500 W条件下，保持30 min。纱布过滤后，冷却备用[5]。
在1 000 mL土豆汁中添加20 g葡萄糖，18g琼脂粉，水浴锅内溶解，待琼脂完全溶解后，进行高压蒸汽灭菌121 ℃×20 min。灭菌结束后取出冷却至50 ℃左右，在无菌净化台上倒平板。待平板凝固后放入35 ℃恒温培养箱中空白培养48 h，检查无染菌后，备用[3]。
1.4.2 摇瓶培养基制备
按照25%玉米粉调浆， 添加2%α-淀粉酶，搅拌均匀后放在水浴锅中，95 ℃条件下，液化大约2 h，碘试不变蓝即为液化合格。取部分的液化液不过滤，再取一部分液化液用滤布过滤出清液，再将液化液、液化清液按照一定比例混合，检测混合液总糖。按照每瓶40 mL装液量分装摇瓶，不补水。121 ℃×20 min条件下灭菌[6]，备用。
1.4.3 麸皮培养基制备
取过16目筛的新鲜大片麸皮，按麸皮∶水=1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入自来水（单位质量，淀粉含量由高到低），拌匀至无干粉又无结团现象。作为对照的麸皮淘洗至水清、水分控制在70%左右。分别将上述不同配方的培养基分装至1 000 mL三角瓶内，每种配方分装6瓶，每瓶装培养基45 g左右。分装后的三角瓶棉塞塞上后用牛皮纸包扎。0.15 MPa，121 ℃条件下，灭菌60 min。灭菌后的麸皮，由于含有淀粉，容易结块。所以待麸皮培养基冷却后，将结块的麸皮进行打散，备用。 不同配方培养基中淀粉含量检测情况见表2。
1.5 接种
在无菌室内，无菌净化台上，火焰下方，每一瓶麸皮培养基分别接入1-2环黑曲霉孢子，接种量控制相同。
1.6 培养
接种后的三角瓶，放置于生化培养箱内。培养箱温度设定35～37 ℃、湿度40%～60%。培养24 h后麸皮培养基表面开始长出白色小菌落，布满麸皮表层，这时开始翻曲一次，使培养基疏松、透气，并铺平瓶底。继续培养，以后，每隔12 h翻曲。麸曲生长至36～48 h，白色菌丝生长达到生长旺盛期，此时产生热量最大，麸曲结块比较严重。如果此时不及时翻曲，容易造成烧曲[6]。所以，36～48 h期间，翻曲的时候，一定要将结块打散，并将麸曲平铺瓶底。
此阶段没有产生孢子。当麸曲培养到48 h以后，开始产生零星孢子，72 h开始布满整个三角瓶，此时翻曲停止。繼续培养至10 d左右，孢子成熟后即可进行下步试验。
1.7 孢子计数
1.7.1 配制0.2%吐温溶液
吸管吸取2 mL吐温-80加入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1 000 mL，加入转子在磁力搅拌器上搅匀。
1.7.2 洗孢子
用量筒量取上述200 mL吐温溶液在通风橱中轻轻地沿瓶壁倒入被测麸曲瓶中，充分摇匀，用纱网过滤。再用200 mL吐温溶液逐步清洗过滤后的麸皮上的孢子，直至麸皮洗白既可。将洗好的孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌均匀。
1.7.3 稀释
取上述孢子悬浮液4 mL于100 mL容量瓶内，加入纯净水定容至100 mL。将稀释后的孢子悬浮液放在超声清洗机内超声10 min。
1.7.4 孢子计数
血球计数板是一块特制的，带有网格的特殊载玻片，载玻片上有4个槽组成3个平台。其中中间被一短槽分成两个部分，每部分上面各刻有方格网，每个方格网总共有九个大格，中间的一大格作为计数用，叫计数区。计数区的刻度分为有两类：一类是计数区为16个大方格，而每个大方格又被分成25个小方格（一般称为16×25）;另一类是一个计数区是25个大方格，而每个大方格又被分成16个小方格（一般称为25×16）。
目前使用的血球计数板规格为25×16。计数区总共有400个小方格，计数区边长1 mm，计数区的面积为l mm2，所以每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4 000 mm3。
取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片，先沾少量水使盖玻片固定在血球计数板上。
将孢子悬浮液摇匀，用胶头滴管吸取少量，从计数板平台两侧的沟槽内快速滴入一小滴（孢子容易沉淀，滴定时一定要快速，而且滴定量不宜过多），让孢子悬浮液利用液体表面张力填满计数区，不要有气泡产生，并用滤纸吸去沟槽中溢出的多余孢子悬浮液。
静置片刻，待孢子沉降到计数板上，不再随液体移动。将血球计数板置于显微镜载物台上，并夹稳，先在150倍显微镜下找到计数区后，再转换600倍显微镜观察，调整粗细螺旋，视野清晰，开始计数。
选择处于4个角上的4个方格和中间的一个方格（每个大方格中有16个小方格），计数，数得5个大方格中的孢子总数N1。
重复上述，操作5次，又可分别得到孢子总数、N2、N3、N4、N5、N6。
计算：
孢子总数（个）=（N1 + N2 + N3 + N4 + N5 + N6）×400×10 000×25×400/（6×80）或 5个大格总数×5×10 000×稀释倍数。
2 结果与分析
2.1 不同淀粉含量对黑曲霉生长的影响
黑曲霉属于半只菌纲，只进行无性繁殖即由孢子发芽开始到新孢子形成、成熟为一个生活周期。黑曲霉孢子在液体培养基里培养，6～8 h开始出芽，逐渐形成菌丝，进一步形成菌球。但是，黑曲霉孢子在固体培养基上，也是先出芽，长出很多芽，逐渐长成菌丝。很快，菌丝开始分枝。由于黑曲霉菌丝有横隔，是多细胞结构[7]。当足细胞长出分生孢子梗时，梗的顶端泡囊开始聚集，并与原生质膜融合，使顶端逐渐膨大形成顶囊。顶囊上面长出二层小梗，接着小梗上长出成链的孢子。这样，黑曲霉菌丝就不断生长，孢子也就不断产生，直至培养基营养耗尽为止[5，8]。
本次试验中，观察黑曲霉生长状态变化，发现84 h以前，淀粉含量高的麸皮培养基菌丝生长快且菌丝长，84 h以后淀粉含量低的培养基孢子产生快。分析认为，在每克培养基中，淀粉含量高的麸皮培养基中，碳源含量丰富，可以为细胞生长提供足够的能量，可以促进黑曲霉菌丝生长，但是由于本试验中淀粉含量高的培养基结团严重，通气性差，不利于黑曲霉孢子着生，所以淀粉含量高可以促进菌丝生长但是对产孢子速度不利。
2.2 不同淀粉含量对黑曲霉的孢子的影响
采用血球计数板方法计数，计数结果见表3。
从表3可以看出，淀粉含量15.56%配方的孢子数最少，淀粉含量13.36%配方的孢子数最多，淀粉含量9.26%配方的孢子数最少。初步分析，孢子数最多的配方培养基中，不仅淀粉含量高达15.56%（干基）。由于培养基中淀粉含量过多，导致培养基淀粉结团严重，导致黑曲霉生长过程中结块不易打散，产生的热量不能散发出去，导致黑曲霉烧曲严重，进而影响黑曲霉产孢量。而淀粉含量13.36%的配方孢子数最多，初步分析，此时培养基中的淀粉含量即碳源含量能够满足黑曲霉生长，而且由于淀粉含量较低，培养基疏松，不易结团，而且利于黑曲霉代谢产生的热量散发出去。另外，由于同等重量的培养基中麸皮含量最多，而孢子产量随麸皮量即麸皮表面积（在一定范围内）的增加而增加。但是淀粉含量9.26%的麸皮培养基，淘洗后丢失的不仅仅是淀粉，同时也会损失其他有利于黑曲霉生长的营养物质，所以导致培养结束的孢子数淀粉含量高的麸曲较少，但是比淀粉含量15.56%的麸曲孢子数多。 综上所述，淀粉含量在9.26%～13.36%利于产孢，淀粉含量13.36%产孢效果最好。
2.3 不同氮源含量对黑曲霉的孢子的影响
培养基中氮源含量与麸曲孢子数量之间的关系如图1所示。
从图1中能够发现，除了1∶0.5配方的麸皮培养基结团严重，烧曲，产孢量极少，其他的配方都显示氮源含量越高，麸曲孢子数量越多。这说明，孢子着生受氮源影响显著[5]。另外，黑曲霉利用营养物质主要是构成菌體、形成各种代谢物、提供能量。其中部分营养物质转化成二氧化碳和水。一般来说，菌体生长阶段，氮源要多[6]。所以，孢子着生阶段，氮源的需求量远大于碳源的需求量，孢子量能够随氮源含量的增加而增加。
2.4 孢子质量验证
称取一定量的成熟麸曲孢子做成孢子悬浮液，稀释一定梯度，涂布PDA平板，培养24 h，菌落计数。这样就可以得到一定浓度的孢子悬浮液。然后按照接种量30万/mL接入配制好的摇瓶培养基中[3]，摇瓶发酵72 h，测酸度。
摇瓶发酵72 h终点，发酵产酸检测见表4。
从表4可以看出四种配方的培养基麸曲发酵结果相差不大，产酸水平基本一致，这说明不同淀粉含量的麸皮培养基培养出的孢子质量基本一致，过筛后的麸皮不经淘洗、其残留的淀粉含量对黑曲霉孢子质量也没有明显影响。分析认为，不同淀粉含量的麸皮虽然对产孢数量有影响，但是对孢子质量影响甚微。而且，淀粉含量大的麸皮培养基在培养过程，由于淀粉高温灭菌后，容易糊化，淀粉粘瓶底严重，不易打散。并且，麸曲培养过程，淀粉含量高的麸曲结团严重，不利于培养过程打散麸曲。
3 结论
培养黑曲霉孢子，利用麸皮培养基作为黑曲霉产孢的载体，麸皮培养基中的淀粉含量能够提高黑曲霉菌丝生长速度，但是不利于黑曲霉产孢速度。麸皮培养基中的淀粉含量过高，造成培养基结团严重，孢子数量减少，淀粉含量过低，培养基中碳源不足，不利于黑曲霉产孢。所以，培养基中淀粉含量对麸曲孢子数量影响较大，但是对孢子质量没有影响。淀粉含量在9.26%～13.36%利于产孢，其中淀粉含量13.36%产孢效果最好。另外，培养基中氮源含量，对麸曲孢子总数影响也显著。
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