鬼针草茎、叶微生物发酵前后总黄酮HPLC色谱图的比较研究

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　　摘      要：对鬼针草茎、叶经微生物发酵前后总黄酮HPLC色谱图进行了分析比较。采用Welch materials-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长360 nm，得HPLC色谱图，再对各色谱图的各色谱峰的相对率进行分析比较。结果鬼针草茎、叶发酵前后HPLC指纹图谱有较明显的改变，各吸收峰相对率也有较显著的改变。微生物发酵使鬼针草总黄酮中某些化学成分发生了生物转化，其化学成分的组成有较显著的变化。
　　关  键  词：鬼针草;总黄酮;微生物发酵;HPLC
　　中图分类号：TQ 041       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）02-0317-04
　　Abstract： To carry out the comparative study on HPLC chromatogram of total flavonoids in the stems and leaves of Bidens bipinnata L. before and after the microbial fermentation，Welch materials-C18 column was used for gradient elution of acetonitrile-0.2% formic acid in aqueous solution， the detection wavelength was 360 nm and the HPLC chromatogram was obtained. Then， the relative rate of each peak of chromatogram was analyzed and compared. The HPLC fingerprints of stems and leaves of Bidens bipinnata L. had obvious changes before and after fermentation， and the relative rates of absorption peaks also had significant changes. Microbial fermentation resulted in the biotransformation of some chemical constituents in the total flavonoids of Bidens bipinnata L.， and the composition of the chemical constituents had significant change.
　　Key words： Bidens bipinnata L.; Total flavonoids; Microbial fermentation; HPLC
　　發酵中药为我国传统中药加工炮制的重要方法之一，具有悠久的历史，目前临床应用的发酵中药品种主要有神曲、半夏曲、红曲、淡豆豉等。利用微生物来发酵中药本质上为利用微生物代谢过程中产生的各种酶类来催化中药中的有效成分的一种生物转化反应。利用微生物强大的生物转化能力可以大幅度提高中药活性成分的含量，或者可以生成新的活性成分，提高中药的药效，降低毒副作用，扩大药用资源等[1-9]。但是传统的中药发酵是一种粗放式的自然发酵，发酵过程不易控制，仅仅利用的是自然界的菌种，且菌种通常不纯，为几种甚至几十种，并且在发酵的过程中极有可能混入有害菌种，这些因素都极大地限制了微生物的作用，使微生物在中药中的应用前景没有最大限度地发挥出来。现代中药发酵技术，又称为中药微生物转化技术，融入了现代生物技术和手段设备的方法，能够准确控制发酵的菌种种类与数量，同时对发酵过程中涉及到的影响发酵的温度、湿度、pH值、时间等因素都可以实现有效准确的动态控制，所得发酵品的质量可控水平大幅度提升。因此利用微生物发酵中药来研究开发特色新药具有广阔的应用前景和挑战。中药鬼针草为鬼针草属植物（Bidens）的干燥全草，目前，国内外对鬼针草的研究主要体现在鬼针草的资源考证及分布、鬼针草中主要化学成分的分离制备、质量标准的建立和鬼针草的药理作用等方面[10-13]，目前对其微生物发酵的报道较少。本课题组前期的研究结果表明发酵鬼针草中的部分成分的含量发生了变化[14，15]，推测其成分组成也有可能不同。本文主要对发酵前后茎、叶纯化后的总黄酮，采用HPLC法研究其总黄酮色谱图的区别，为微生物发酵鬼针草的药效学研究提供依据。
　　1  仪器、材料
　　DT-100型分析天平（北京医用仪器厂），Agilent 1100型高效液相色谱仪配有DAD检测器（美国安捷伦公司）;石油醚、甲醇均为分析纯，购于天津市富宇精细化工有限公司;乙腈（色谱纯）、甲酸（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司;药材鬼针草自采于济南市郊区，经鉴定为菊科鬼针草属植物鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草。
　　2  方法、结果
　　2.1  鬼针草茎和叶微生物发酵前后样品的处理
　　2.1.1  鬼针草茎和叶的微生物发酵液的制备
　　称取鬼针草茎、叶粗粉各适量，加15倍量水浸泡30 min后于115 ℃灭菌50 min，冷却以后接入预培养的短双歧杆菌菌液，接种量为1%，于37 ℃培养6 h后接入嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌，接种量均为0.5%，继续培养共72 h后结束。将发酵液加热至沸灭菌，中药渣挤干，挤出液离心，转速为4 000 r·min-1，离心后的发酵液分装于250 mL玻璃瓶，115 ℃灭菌30 min，得发酵成品，茎和叶的发酵液浓度均为10%。 　　2.1.2  鬼针草茎和叶水提液的制备
　　称取鬼针草茎和叶粗粉各10 g，加15倍量水浸泡30 min后加热煮沸提取60 min，过滤，药渣再用10倍量水煮沸提取一次，过滤，合并两次滤液浓缩后用水定容至100 mL得茎和叶的水提液，浓度均为10%。
　　2.1.3  鬼针草茎、叶发酵液和水提液中总黄酮纯化
　　精确量取鬼针草茎、叶发酵液、鬼针草茎、叶水提液各100 mL（各相当于原药材10 g），各用石油醚萃取两次，水层上样于预处理过的HPD100型大孔树脂，树脂用量均为300 mL，树脂柱径高比均为1∶12，上样流速2 VB·h-1。用水洗脱2倍柱体积后再用60%乙醇洗脫8倍柱体积，将60%乙醇洗脱液合并回收溶剂，干燥得纯化总黄酮。
　　2.2  供试品溶液的制备
　　精密称取2.1.3项下的总黄酮各100 mg， 用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，取续滤液作为鬼针草茎、叶微生物发酵前后供试品溶液。
　　2.3  HPLC色谱条件
　　采用Welch materials C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，以乙腈（A）- 0.2%甲酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱，流速1 mL·min-1，A∶B的比例见表1。检测波长360 nm，进样量20 μL。
　　2.4  HPLC色谱条件方法学考察[16，17]
　　2.4.1  精密度试验
　　取同一个供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录HPLC图，计算各色谱峰的相对保留时间和各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于0.83 %、1.72 %（n=6），表明仪器的精密度良好。
　　2.4.2  稳定性试验
　　精密吸取同一供试品溶液分别在0，2，4，8，12，24 h进样进行检测。各色谱峰的相对保留时间和各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于0.92%、1.89%（n=6），表明样品溶液在24 h内稳定。
　　2.4.3  重复性试验
　　精密称取6份样品，按供试品溶液制备方法制备供试液，注入高效液相色谱仪进行测定，各色谱峰的相对保留时间和各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于0.76%、2.85%（n=6），表明方法的重复性良好。
　　2.5  供试品溶液的HPLC指纹图谱的测定
　　将2.2项下制备的4种供试品溶液，按2.3项下的色谱条件分别进行检测，记录HPLC图，结果见图1。
　　2.6  结果
　　鬼针草茎、叶发酵前后HPLC指纹图谱有较明显的改变。鬼针草叶水提液中色谱峰最多，以它为对照标示出23个吸收峰，其中10号峰为异槲皮苷的吸收峰。鬼针草发酵叶中没有12号、14号、20号、23号明显的吸收峰;鬼针草水提茎、发酵茎中无14号、17号、18号、21号明显的吸收峰，但有较明显的23号峰的吸收。其他吸收峰之间的相对比例也有较显著的改变。
　　对各自样品以自身10号峰即异槲皮苷的峰面积为分母，其他各峰峰面积分别为分子，计算出各峰的相对率，结果见表2。以各色谱峰相对率作柱状图，见图2、3。
　　由图2、图3柱状图可见，鬼针草叶发酵后色谱峰相对率明显升高的峰有1、2、3、4、5、7、15、16、19、21号峰;鬼针草茎发酵后色谱峰相对率明显升高的峰有1、2、3、5、8、、9、20、23号峰。
　　由结果可知，鬼针草发酵前后化学成分的组成有较显著的变化。
　　3  讨论
　　实验考察了样品在多种检测波长下的色谱图并进行比较，结果显示各样品在360 nm波长下均具有较大的吸收，吸收峰较多，基线较平稳，因此本实验最终确定的检测波长为360 nm。
　　鬼针草茎、和叶的组织构造不同，以上研究表明，鬼针草茎中的化学成分组成和含量均要少于鬼针草叶。通过比较分析鬼针草茎和叶经微生物发酵前后纯化后的总黄酮HPLC色谱图的变化可知，鬼针草经微生物发酵以后化学成分的组成和某些成分的相对含量均有较显著的变化。鬼针草叶纯化后总黄酮的12号峰和14号峰发酵后没有检测到明显的吸收峰，可能是该成分在微生物发酵的过程中进行了生物转化从而转化成其他物质，至于12号峰和14号峰所对应的化合物的具体结构还需要进行进一步的研究。
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