miR-449对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的机制研究

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　　摘要：目的  探究miR-449是否具有調控骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨分化的作用。方法  分离、培养骨髓MSCs，采用流式细胞仪检测CD44、CD29、CD34、CD45等表面相关标志抗原的表达鉴定骨髓MSCs;将MSCs分为对照组、miR-449a组、miR-449b组及anti-miR-449组，对照组用成骨诱导培养基培养，其余各组分别经miR-449a/b或inhibitors转染后在成骨诱导培养基培养，分别于培养第3、6、9、12天检测各组碱性磷酸酶活性，qRT-PCR检测miR-449a/b对成骨特异性基因Runx2、Osterix表达的影响。结果  ①第4代间充质干细胞CD44、CD29表达阳性，而CD34 和CD45表达阴性，符合骨髓间充质干细胞的特征。②成骨诱导培养3、6、9、12 d后，MSCs细胞碱性磷酸酶活性较上一时间点升高，且呈时间依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）;MSCs成骨诱导培养3、6、9、12 d后，Runx2、Osterix表达水平逐渐升高。③miR-449a组和miR-449b组AKP活性低于对照组，而anti-miR-449组AKP活性升高，差异有统计学意义（P<0.05）;miR-449a组和miR-449b组 Runx2、Osterix表达较对照组下调，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  本次实验成功分离、培养了骨髓MSCs，其具有体外成骨分化能力，而miR-449能抑制骨髓MSCs向成骨分化。
　　关键词：miR-449 a/b;间充质干细胞;成骨分化
　　中图分类号：R329                                 文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.021
　　文章编号：1006-1959（2020）04-0069-04
　　Abstract：Objective  To investigate whether miR-449 can regulate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs）. Methods  Bone marrow MSCs were isolated and cultured. Flow cytometry was used to detect the expression of surface-associated marker antigens such as CD44， CD29， CD34， and CD45. Bone marrow MSCs were identified. The MSCs were divided into control group， miR-449a group， miR-449b group，and anti-miR-449 group， the control group was cultured with osteogenic induction medium， and the remaining groups were cultured in osteogenic induction medium after transfection with miR-449a / b or inhibitors， respectively in culture 3， 6， 9， and12 d， the alkaline phosphatase activity was detected in each group， and the effect of miR-449a / b on the expression of osteogenic specific genes Runx2 and Osterix was detected by qRT-PCR. Results  ①The fourth generation of mesenchymal stem cells was positive for CD44 and CD29， while the expression of CD34 and CD45 was negative， which is in line with the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells. ②After 3， 6， 9， 12 d of osteogenic induction culture， the alkaline phosphatase activity of MSCs cells increased compared with the previous time point， and it was time-dependent，the difference was statistically significant （P<0.05）. After 3，6，9，12 d of osteogenic induction of MSCs， the expression levels of Runx2 and Osterix gradually increased. ③The AKP activity of miR-449a group and miR-449b group was lower than the control group， while the anti-miR-449 group increased AKP activity， the difference was statistically significant （P<0.05）; miR-449a group and miR-449b group Runx2， Osterix expression was down-regulated compared with the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  This experiment successfully isolated and cultured bone marrow MSCs， which has the ability to differentiate into bone in vitro， and miR-449 can inhibit the differentiation of bone marrow MSCs into osteogenesis. 　　Key words：miR-449 a/b;Mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation
　　骨质疏松症（osteoporosis）已成为威胁人类健康的主要疾病之一，如何增强骨再生能力是治疗这类疾病的关键。骨组织是一种动态地不断更新的组织，主要由两种细胞行使功能来达到动态平衡状态，即促进骨形成的成骨细胞（osteoblast）和促进骨吸收的破骨细胞（osteoclast），一旦这种平衡状态被破坏，就会引发骨质疏松等骨代谢性疾病[1]。目前间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的多能基质细胞，在不同條件下可以诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种结缔组织细胞[1-4]，已成为骨组织工程中理想的种子细胞。自体MSCs移植可避免机体自身的免疫排斥反应而被认为是生物安全性更高的细胞治疗手段。但骨质疏松患者自体分离的间充质干细胞的成骨能力存在明显的缺陷。因此，将自体干细胞治疗应用于骨质疏松患者的骨修复，首先需找到一个靶点逆转骨质疏松患者自身的间充质干细胞的成骨能力的缺陷。为此，本研究以骨髓间充质干细胞为研究对象，探讨miR-449调控MSCs成骨分化的作用及机制，旨在揭示miR-449拮抗剂用于骨质疏松症的治疗潜能，为以miR-449为靶点开发药物应用于骨质疏松等多种骨代谢疾病的治疗提供理论和实验依据。
　　1材料与方法
　　1.1试剂及材料  MSCs来源于健康青年女性志愿者捐献的骨髓，Lipofectamine2000转染试剂、TRIzol购自美国Invitrogen公司;miR-499 mimics及inhibitors为美国Ambion公司产品;SYBR Premix ExTaqTM定量PCR试剂、T4-DNA连接酶、SpeⅠ和Hin dⅢ限制性内切酶均为大连宝生物公司产品;qRT-PCR miRNA Detection Kit购自广州天根生物公司;a-MEM培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清来自杭州四季青公司。
　　1.2方法
　　1.2.1分组  对照组：成骨诱导培养基培养9 d;miR-449a组、miR-449b组：经miR-449a/b转染骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基培养9 d;anti-miR-449组：经miR-449 inhibitors转染骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基培养9 d。通过检测各组碱性磷酸酶活性和成骨分化特异基因Runx2、Osterix的表达观察骨髓间充质干细胞成骨分化能力。
　　1.2.2细胞的分离、培养及诱导  采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs，用含10%胎牛血清及双抗的a-MEM细胞培养液培养。采用流式细胞仪检测CD44、CD29、CD34、CD45等表面相关标志抗原的表达鉴定骨髓MSCs。本实验所用MSCs均为第4代，经不同的理后接种于6孔板中，待细胞融合度达60%时，加入成骨诱导培养基（0.1 μmol/L地塞米松，50 μg/ml维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠）进行成骨分化诱导。
　　1.2.3细胞转染  将细胞接种于6孔板中，待细胞培养至60%融合进行转染。加入5 μl的脂质体于250 μl无血清培养基中，室温混匀静置5 min;在另一管中加入100 pmol miRNA mimics或siRNA于250 μl无血清培养基中;将上述两管混合，室温静置45 min;洗涤细胞2次;加入1.5 ml无抗生素无血清培养基;将上述混合物加入6孔板中，37℃培养4～6 h后换成完全培养基继续培养。
　　1.2.4 qRT-PCR检测  细胞总RNA按TRIzol试剂盒说明书常规提取，测浓度;反转录反应按美国Promega公司反转录试剂盒说明书进行;qRT-PCR按宝生物公司SYBRPremix ExTaqTM试剂盒说明书进行。采用Bio-Rad IQ5实时定量PCR仪进行PCR反应，反应条件：预反应，95℃30 s;然后95 ℃ 5 s，60℃30 s，40个循环后，测定ΔCT值，以GAPDH为内参照。
　　1.2.5碱性磷酸酶活性检测  细胞处理后，于成骨诱导培养液培养第3、6、9、12天收集细胞，抽提总蛋白，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒说明书进行碱性磷酸酶活性检测。
　　1.3统计学处理  采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，数据以（x±s）表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1骨髓MSCs 的分离、培养和鉴定  第4代间充质干细胞CD44、CD29表达阳性，而CD34 和CD45表达阴性，见图1，符合骨髓间充质干细胞的特征。
　　2.2 MSCs成骨分化能力  碱性磷酸酶活性检测显示，成骨诱导培养3、6、9、12 d后，MSCs细胞碱性磷酸酶活性较上一时间点升高，且呈时间依赖性，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。qRT-PCR 检测结果显示，MSCs在成骨诱导培养3、6、9、12 d后，Runx2、Osterix表达水平逐渐升高，见图3。
　　2.3 miR-449 对骨髓MSCs成骨分化的影响  AKP活性检测结果显示，与对照组相比，miR-449a组和miR-449b组AKP活性低于转染对照细胞，而anti-miR-449组AKP活性升高，差异有统计学意义（P<0.05）;qRT-PCR检测转染miR-449a/b和miR-449 inhibitors对成骨特异性基因Runx2、Osterix表达的影响显示，与对照组相比，miR-449a组和miR-449b组 Runx2、Osterix表达均下调，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。 　　3讨论
　　BMP/ Smad信号通路调控成骨化和成软骨化，是骨形成中最重要的一条信号通路。其中Smad4（mothers against decapentaplegic homolog 4）是BMP/Smad骨形成信号通路的中心介导者。Smadl/5/8 磷酸化后与Smad4形成复合物后进入到细胞核内调控成骨分化关键基因Runx2、Osterix等的转录，从而实现对成骨分化和骨成熟的调控[4，5]。本研究通过Targetscan等在线软件预测miR-449靶基因，发现Smad4是miR-449a/b潜在的靶基因。因此推测miR-449可能通过靶向调节Smad4表达来调控成骨分化关键基因Runx2、Osterix等的转录，从而影响MSCs成骨分化。
　　miRNAs作为一种新型的基因转录后调控方式，与组织器官发育、细胞生长、分化、凋亡、细胞运动、新陈代谢和疾病发生等生命活动密切相关[6]。越来越多的研究表明miRNA 在干细胞的自我更新和多向分化过程中发挥重要的调控作用[7]。已有研究[9]发现miRNAs在调控MSCs或前体细胞成骨、成软骨及成脂分化过程中也发挥重要生物学功能。miR-449能抑制MSCs向成骨分化，但具体的分子机制或靶基因调控作用尚不明确。
　　本研究通过分离、培养骨髓MSCs，鉴定其成骨分化能力，在骨髓MSCs转染经特殊化学修饰的miR-449 a/bmimics或inhibitors，通过qRT-PCR检测过表达miR-449a/b对成骨特异性基因Runx2、Osterix表达的影响。结果显示过表达miR-449a/b后Runx2及Osterix表达较对照细胞下调，表明miR-449能通过下调Runx2及Osterix表达抑制骨髓MSCs细胞向成骨分化。从而可能在骨质疏松、骨折愈合与骨不连的发生发展中发挥重要作用，因此，以miR-449为靶点开发的药物有望用于骨质疏松等多种骨代谢疾病的治疗或者逆转骨质疏松患者自体分离的间充质干细胞的成骨能力表现出明显的缺陷，从而将自体干细胞治疗应用于骨质疏松条件下的骨修复成为现实。
　　综上所述，miR-449能抑制骨髓间充质干细胞向成骨分化，未来可以miR-449为靶点开发相关药物治疗多种骨代谢疾病。
　　参考文献：
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　　[9]彭俊，劉英杰，宗阳，等.miR-125b调控Runx2/Osx表达对骨髓间充质干细胞成骨机制的影响[J].东南国防医药，2019，21（2）：124-129.
　　收稿日期：2019-12-04;修回日期：2019-12-23
　　编辑/成森
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