复方葛根素水飞蓟宾固体分散体的制备及表征
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作者:郭爱灵 姚涛 潘斯庆 周刘华 田雄 常跃兴
摘要：目的 筛选复方葛根素水飞蓟宾固体分散体的制剂处方。方法 以体外速释性为考察指标，优选药物在固体分散体中的存在形式以及药物与辅料配比;以热分析法、红外色谱法、X单晶衍射法对药物在制剂处方中的物相进行鉴定。结果 优选的制剂处方为：将水飞蓟宾与聚乙烯吡咯烷酮k30以1∶3比例制成固体分散体，再加入与水飞蓟宾等量的葛根素，与水飞蓟宾固体分散体混匀。结论 该中间体制剂处方可用于進一步复方制剂。
关键词：葛根素;水飞蓟宾;固体分散体;物相鉴定
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）02-0059-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2020.02.201903393 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Preparation and Characterization of Compound Puerarin Silybin Solid Dispersions
GUO Ailing1， 2， YAO Tao1， PAN Siqing1， ZHOU Liuhua1， TIAN Xiong1， CHANG Yuexing1， 2
1. Medical College， Anhui University of Science & Technology， Huainan 232001， China;
2. Medical Frontier Experimental Center， Anhui University of Science & Technology， Huainan 232001， China
Abstract： Objective To screen the preparation of compound puerarin silybin solid dispersions. Methods With in vitro rapid release as the evaluation index， the existing forms of medicine in solid dispersions and the ratio of medicine and excipients were optimized， and the phase of the medicine in the prescriptions of preparation was identified by thermal analysis， infrared chromatography and X-ray single crystal diffraction. Results The optimal prescription was as follows： silybin and PVPk30 were prepared into solid dispersions in a ratio of 1：3， and puerarin equal to silybin was added to mix with the silybin solid dispersions. Conclusion The preparation of the intermediate system can be used for the further compound preparations.
Keywords： puerarin; silybin; solid dispersions; phase identification
酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）系由长期大量饮酒导致的肝脏疾病，初期通常表现为轻型ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。ALD是肝硬化的首要病因，目前我国饮酒人群比例和ALD患病率均呈上升趋势[1]。ALD治疗原则是：戒酒和营养支持，减轻ALD的严重程度，改善已存在的继发性营养不良和对症治疗酒精性肝硬化及其并发症[2-4]。葛根素（puerarin，Pue）是由野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根中提取的异黄酮类成分，临床用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、ALD等[5-7]。水飞蓟宾（silybin，Sil）是由菊科植物水飞蓟Silybum marianum（L.）Gaertn.的干燥果实中提取的黄酮类化合物，临床用于治疗ALD[8]、心肌缺血[9]及肝癌[10]等。Pue和Sil均难溶于水，用固体分散体（solid dispersion，SD）技术改善水难溶药物的溶解度，简便易行而更有优势。本研究在前期含量测定[11]和提取工艺优化[12]的基础上，以体外速释性为指标，以物理混合物（physical mixture，PM）为对照，对复方葛根素水飞蓟宾固体分散体制备工艺进行考察，并对药物在SD中的物相进行鉴定。
1 仪器与试药
E2695型高效液相色谱仪，配2489紫外-可见检测器和Symmetry型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Waters公司;D8 Advance型X射线衍射仪，德国布鲁克公司;Nicolet iS 10型红外光谱仪，美国尼高力公司;MS105DU型十万分之一天平，梅特勒-托利多上海有限公司;HCT-1型综合热分析仪，北京恒久实验设备有限公司;ZNCL-BS型数显恒温磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司;YCD-EL259型低温冰箱，中科美菱低温科技股份有限公司;DHG-9070B型电热恒温干燥箱，上海培因实验仪器有限公司。 Pue（批号20180429，纯度98%），西安三江生物工程有限公司;Sil（批号YL-20180626，纯度98%），山西瑜莱生物科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮k30（PVPk30，批号P151018016-1，分析纯），博爱新开源制药股份有限公司;十二烷基硫酸钠（SDS，批号20161121，分析纯），国药集团化学试剂有限公司;甲醇为色谱纯，德国Merck公司;水为三蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 葛根素和水飞蓟宾含量测定
2.1.1 色谱条件
流动相为甲醇-水（51∶49），流速为1.0 mL/min，0～5 min检测波长为250 nm，5～12 min检测波长为288 nm，柱温30 ℃，在高效液相色谱仪上自动进样10 μL待测溶液，分析时间为12.0 min。结果待测峰均与相邻峰在基线达到完全分离（见图1），该色谱条件可用于同时测定复方葛根素水飞蓟宾固体分散体中Pue和Sil的含量。
2.1.2 溶液制备
分别精密称取Pue 11.79 mg、Sil 10.05 mg，置于25 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，加甲醇至刻度线，振荡摇匀，即得浓度为471.6 μg/mL Pue和402.0 μg/mL Sil的混合溶液，作为混合原料药母液。取上述母液200 μL，置于10 mL容量瓶中，用0.5% SDS水溶液定容至刻线，摇匀，即得原料药混合溶液。以0.5%SDS水溶液为释放介质，制备复方葛根素水飞蓟宾固体分散体释放所得溶液，为含药体外释放液。以0.5%SDS水溶液为阴性空白溶液。
2.1.3 线性关系考察
分别取“2.1.2”项下混合原料药母液50、100、200、500、1000 μL，置于5个10 mL容量瓶中，用0.5%SDS水溶液定容至刻线，摇匀，即得浓度分别为2.01、4.02、8.04、20.1、40.2 μg/mL Sil和浓度分别为2.358、4.716、9.432、23.58、47.16 μg/mL Pue的混合稀释溶液，取10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。以浓度对峰面积进行线性回归，计算得Pue线性方程为Y=39 620X-5175.5（r=0.999 9），Sil线性方程为Y=19 456X-2455.4（r=0.999 9）。结果表明，Pue溶液在2.358～47.16 μg/mL范围内、Sil溶液在2.01～40.2 μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.4 精密度试验
分别取“2.1.2”项下混合原料药母液的低、中、高浓度稀释液，各依次连续进样6次测定，并于第2、3日继续进行测定，计算药物浓度，并分别计算日内精密度和日间精密度。结果显示，低、中、高浓度Pue溶液RSD分别为0.51%、0.91%、0.58%，Sil溶液RSD为0.32%、0.96%、0.91%，表明仪器精密度良好。
2.1.5 稳定性试验
取含药体外释放液，分别于0、6、12、18、24 h进样测定Pue和Sil浓度，结果Pue和Sil浓度RSD分别为0.75%、0.97%。表明待测溶液在24 h内稳定性良好。
2.2 固体分散体及物理混合物的制备
分别称取一定质量比例的Pue、Sil和PVPk30，加入适量无水乙醇，超声助溶。待所有物质完全溶解后，在温度45 ℃、转速1000 r/min条件下磁力搅拌至乙醇基本挥干，再均匀铺于干燥洁净的玻璃板上，40 ℃烘箱烘干，刮下干燥物，研钵研磨至全部过80目筛，即得Pue-Sil SD，置于干燥器内保存备用。称取其中一种药物和PVPk30，同法制得单一药物SD。
分别称取一定质量比例的Pue、Sil和PVPk30，过80目筛，混合均匀，即得Pue-Sil-PVPk30 PM，置于干燥器内保存备用。称取其中一种药物和PVPk30，同法制得单一药物PM。
2.3 体外溶出速率测定及处方优化
2.3.1 体外溶出速率测定
精密称取一定量Pue及Sil原料药、物理混合物及SD，均匀撒于装有0.5%SDS水溶液250 mL的三角瓶中，加热温度37 ℃，磁力搅拌速率200 r/min，分别于1、3、5、10、15、30、45、60 min吸取200 μL释放液，并补充等体积0.5%SDS水溶液。释放液以0.5%SDS水溶液稀释10倍后进样10 μL测定，计算Pue和Sil峰面积及累计释放量。不同存在形式的Pue和Sil体外释放曲线见图2、图3。
从图2可知，Pue以原料药和PM形式存在比以SD形式存在释放快。可见，Pue制成SD不能增加其体外溶出速率，而加入PVPk30或Sil与之制成PM则明显提高其体外溶出速率。因此，制剂时可考虑将Pue制成PM形式。
从图3可知，Sil以原料药和PM形式存在比以SD形式存在释放慢。可见，Sil制成SD能明显增加其体外溶出速率，而加入PVPk30或Sil与之制成PM则对其体外溶出速率影响不大。因此，制剂时可考虑将Sil制成SD形式。
2.3.2 驗证试验
按“2.3.1”项下处方优化原则，平行制备3批
[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM，按“2.3.1”项下条件测定Pue和Sil的体外溶出速率，结果表明，该处方工艺能使Pue和Sil均较快释放。
2.4 物态鉴定
2.4.1 差示扫描量热分析 分别精密称取PVPk30、Sil、Pue、Pue-PVPk30（1∶3）PM、Pue-PVPk30（1∶3）SD、Sil-PVPk30（1∶3）PM、Sil-PVPk30（1∶3）SD、Sil-Pue-PVPk30（1∶1∶3）PM及[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM粉末各约10 mg，置于陶瓷坩埚内，放入综合热分析仪相应的载物台，进行差示扫描量热（DSC）分析。分析条件：初温20 min，保持5 min，以20 ℃/min升温至350 ℃。绘制热流量随温度变化的曲线，结果见图4。可以看出，与PVPk30、Pue及Sil相比，Pue-PVPk30（1∶3）SD及Sil-PVPk30（1∶3）SD未出现Pue和Sil的吸收峰，而在相应位置处Pue-PVPk30（1∶1）PM、Sil-Pue-PVPk30（1∶1∶3）PM、[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM均出现PVPk30、Pue及Sil的吸收峰，表明Pue和Sil在[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM中分别以晶体和无定形状态存在。
2.4.2 傅里叶变换红外光谱分析
采用KBr压片法，在波数4000～400 cm-1范围内分别对PVPk30、Sil、Pue、Sil-Pue-PVPk30（1∶1∶3）PM及[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，考察药物Pue、Sil与载体PVPk30间是否存在相互作用。各物质FTIR图见图5。
对比各待测物质在波数3200 cm-1处的吸收峰，可知其為Pue特征吸收峰，且Pue与PVPk30、Sil间无相互作用。对比3450 cm-1处的吸收峰，可知其为Sil特征吸收峰，对比图5B和图5C可知，复方葛根素水飞蓟宾固体分散体中Sil吸收峰位从3450 cm-1移至3400 cm-1处，而PM中Sil吸收峰位几乎没变，但峰变宽，因此Sil与PVPk30之间可能形成氢键。
2.4.3 粉末X射线衍射分析
采用粉末X射线衍射仪对PVPk30、Sil、Pue、Sil-Pue-PVPk30（1∶1∶3）PM及[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM进行粉末X射线衍射（XRD）分析。分析条件：Cu-Kα辐射靶波长1.5406 ?，管电流40 mA，管电压40 kV，扫描范围5°～50°（2θ），步长0.02 ℃，扫描速率3°/min。各待测物质XRD图见图6。
从图6可以看出，PVPK30为无定形状态，Pue和Sil原料药粉末为晶体，Sil-Pue-PVPk30（1∶1∶1）PM中的Pue和Sil仍为晶体;[Sil-PVPk30（1∶3）SD]-Pue（4∶1）PM中的Pue仍为晶体，而Sil为无定形状态。
3 讨论
通过考察Pue不同存在形式对其速释性的影响发现，与物理混合物相比，Pue制成SD并不能提高其速释性，但仍比原料药形式速释性明显增强，其原因可能在于PVPk30极易溶于水，在水中成为Pue的助溶剂。推测PVPk30在水中与Pue形成可溶性络合物、复盐或分子缔合物，从而使Pue在水中的溶解度明显增加，具体原理有待进一步研究。
通过考察Sil不同存在形式对其速释性的影响发现，与Sil原料药相比，PM并不能提高其速释性，而制成SD可提高其速释性，因此最终选择Sil制成SD。可能由于Sil的结构与溶液中的PVPk30不能形成相应可溶性较好的络合物、复盐或分子缔合物，而制成SD后，Sil在PVPk30中分散性增强，也可能形成了氢键，使其速释性明显提高。
本研究最终确定Sil与PVPk30先制成SD，再与Pue物理混合均匀，其原因在于PVPk30与水接触后极易溶于水而使Sil迅速释放，此时Pue与PVPk30的水溶液相互作用，帮助Pue迅速溶解，最终在尽量少加辅料的前提下使复方药物均能迅速溶解。复方葛根素水飞蓟宾固体分散体是否具有一定的体内速释性，能否提高口服生物利用度，尚待进一步研究。
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（收稿日期：2019-03-29）
（修回日期：2019-05-05;编辑：陈静）
基金项目：2015年安徽理工大学引进人才基金项目（11079）;安徽理工大学大学生创新创业训练计划项目（201710361100、201710361103）
通讯作者：常跃兴，E-mail：yxchang@aust.edu.cn
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