遮放镇西番莲果腐病的病原菌鉴定

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　　摘 要 采用Koch法则对西番莲病果样品进行病原菌的分离和致病性测试，并采用形态学与分子生物学相结合的方法鉴定病原菌。结果表明，分离得到的编号为XFL20190803的病原菌为西番莲果腐病的致病菌;对其进行的形态特征观察及菌丝ITS1/ITS4序列在NCBI上的同源性比较结果表明，XFL20190803为烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。
　　关键词 西番莲;果腐病;烟草疫霉菌
　　中图分类号：S436.67 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.05.014
　　西番莲（Passiflmne hdissims）又名百香果、鸡蛋果、热情果，原产于南美，是多年生热带、亚热带水果，其香气浓郁，营养丰富，是一种高级的天然饮料，被誉为天然水果之王，深受消费者的喜爱。我国在广西、广东、海南、福建等地已有大量种植，近些年在云南省的种植面积大幅上升。2019年8月3日，在德宏州芒市遮放镇的西番莲种植地（24°11′30″N，98°11′2″E）观察到西番莲发生严重的果腐病，感病果湿腐，病斑边缘水渍状，病斑深入果肉，造成大量落果，发病率达到56%以上。为使西番莲果腐病得到有效控制，笔者将感病果带回实验室，对西番莲果腐病的病原菌进行研究，为广大种植户提供防治依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　分离材料：感病西番莲采集于云南省德宏州遮放镇西番莲种植园;玉米培养基：玉米粉300 g、琼脂20 g、水1 000 mL;琼脂培养基：琼脂17 g，水1 000 mL;皮氏培养液：Ca（NO3）2 0.40 g，KH2PO4 0.15 g，Mg（NO3）2 0.15 g，CaCl2 0.06 g，蒸馏水1 000 mL;致病接种果：来源于云南省热带作物科学研究所。
　　真菌菌丝DNA快速抽提试剂盒、ITS1/ITS4和PCR扩增等引物由生工生物工程（上海）技术服务有限公司提供。
　　1.2 方法
　　参照Koch法则[1]。
　　1.2.1 病原的分離培养
　　将病果用自来水清洗，表面用75%酒精消毒2次，用灭菌刀削去病斑表层皮，把斑病健交界组织切成大小4 mm×4 mm左右的方块，把组织片置于玉米培养基上，在25 ℃条件下培养。3～4 d后出现一些菌落，用灭菌针挑取少量菌丝移接到玉米培养基上培养5 d，选取具有代表性的优势菌落进行单菌丝分离、纯化培养，得到纯培养菌种用于致病性测试。
　　1.2.2 致病性测试
　　采用无伤接种。将无病虫害、未成熟西番莲果用自来水清洗，晾干表面的水分后待用;培养5 d的待测试菌种用接种针划成约5 mm×5 mm的菌块备用;将备好的测试菌块有菌丝的一面分别贴到准备好的西番莲果上，每个果接种1菌块，对照组接种同样大小的无菌玉米培养基块。接种果放入保湿缸内，在25～28 ℃室温下保湿培养，3～4 d后取出观察接种感病情况。接种果致病后，随即进行病原再分离，若分离得到与测试菌种一致，即可确认为致病菌。
　　1.2.3 病原鉴定
　　根据菌落和孢子囊的形态特征，参照《疫霉菌及其研究技术》[2]进行鉴定。
　　1.2.3.1形态鉴定
　　1）菌落形态：将纯培养菌转接到新玉米培养基上，在26 ℃室温、自然光照条件下培养5 d，观察菌落的生长情况、菌丝宽度等。2）孢子囊形成：将凹面玻片用75%的酒精表面消毒，晾干备用;用灭菌针挑取大小约2.5 mm×2.5 mm的菌块置于玻片的凹面中，在凹面中加入约3 mL的皮氏培养液，将载有菌块的玻片放于直径9 cm培养皿中，再将培养皿置于25～28 ℃、自然光照下的培养缸中保湿培养24～48 h，观察孢子囊的形成及形态特征。3）厚垣孢子形成：将在玉米培养基上接种病原菌的培养皿置于26 ℃、空气湿度（RH）65%的室内、自然光照下培养10～15 d，观察厚垣孢子的形成及形态。
　　1.2.3.2分子生物学鉴定
　　从菌丝体中提取DNA测序，利用ITS1/ITS4引物扩增、测序[3]，使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因组试剂盒（DP320-02）进行真菌DNA提取，提取方法参照其说明。rDNA ITS区序列扩增及分析采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），扩增该病菌5.8S rDNA及其两边的ITS1和ITS4基因片段。
　　扩增反应体系为：真菌DNA模板0.5～1.0 μL，ITS1（10 μm）1μL，ITS4（10 μm）1 μL，2×Master Mix12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR扩增程序为：预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环;最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶回收，纯化后的PCR产物克隆至Pgem-T-easy载体，由上海生物工程技术服务有限公司完成测序。将该病菌的ITS序列在NCBI网站上进行BLAST同源性比较，通过MEGA7软件构建病原菌与近源物种的系统发育树，分析和确定其分类地位。
　　2 结果与分析
　　2.1 病原分离
　　从12个病果上分离病原，每个病果取样3个，36个样品在玉米培养基上培养4 d后得到29个菌落，7个为真菌、细菌混合，得菌率80.5%。用灭菌针分别挑取少量菌丝移接到玉米培养基上培养4 d得到的29个菌落，经镜检为1种真菌。选取具有代表性的优势菌落在琼脂平板上培养3 d，进行单菌丝分离，得到纯培养菌种，编号为XFL20190803，将XFL20190803在PDA上培养5 d，用于致病性测试。 　　2.2 致病性测试
　　将培养好的菌种打成直径为5 mm的菌块接种在备好的西番莲果上，接种3 d后，接种菌块表现出与田间一致的感病症状，对照组不感病。对出现症状的感病果进行病原再分离，得到与接种测试菌种一致，确认XFL20190803为西番莲果腐病的致病菌。
　　2.3 病原鉴定
　　2.3.1 形态鉴定
　　2.3.1.1菌落形态
　　在玉米培养基上培养5 d，菌落白色，气生菌丝生长旺盛，粗细不匀，宽5～10 μm。菌丝膨大，孢囊梗不规则分枝。
　　2.3.1.2孢子囊形成
　　在皮氏液培养36 h，形成大量的孢子囊，孢子囊卵圆形至近圆形，少数椭圆形，大小（23～60）μm×（19～50）μm，部分孢子上有丝状附属物。孢子囊具乳突，通常1个，少数2个，乳突大多明显，半球形。孢子囊顶生，常不对称，具脱落性，孢囊柄短，0.5～4.8 μm。排孢孔宽4.5～8.0 μm。
　　2.3.1.3厚垣孢子形成
　　菌落在玉米培养基上置于26 ℃、65%RH室内、室内自然光照下培养10 d，有厚垣孢子形成。厚垣孢子顶生或间生，近球形，直径20～38 μm。
　　根据菌落形态和孢子囊、厚垣孢子的形态特征，鉴定为烟草疫霉菌。
　　2.3.2 分子生物学鉴定
　　利用ITS1/ITS4引物提取、扩增菌株DNA的ITS片段，获得837 bp、668 bp 2个ITS序列（登录号为MN922945、MN945401），在NCBI网站上进行同源性比较，通过BLAST搜索核酸数据库显示，MN922945与已报道Phytophthora nicotianae的ITS 序列中KT148947、MH341621相似度为99.28%和100%。通过MEGA7软件构建病原菌XFL20190803 ITS系列与近源物种的系统发育树，结果显示病原菌XFL20190803与P. nicotianae的菌株CNRnico8RE和CNRnico62RC位于同一分枝，支持率為100%。
　　病原菌XFL20190803的形态鉴定与分子生物学鉴定结果一致，确定病原菌为P. nicotianae。
　　3 小结与讨论
　　烟草疫霉（P. nicotianae）异名寄生疫霉菌（P. parasitica），寄主广泛，我国已报道的寄主有番木瓜、番荔枝、菠萝、阳桃、番木瓜、柚、柑桔、西番莲、番石榴等热带果树和草莓、烟草、黄瓜、蕃茄等[4]，以及文殊兰、康乃馨等多种花卉共50多种，在台湾种植区也分离到此病原菌[5]。在广东种植区，有烟草疫霉侵染西番莲幼苗的报道，在成龄株中很少发生，其侵染部位多见于叶片、茎蔓、果实中，少见于茎基部[6];在福建种植区也有西番莲疫病发生，轻者引起落叶落果，重则引起整株或大面积死亡，其病原菌经鉴定为烟草疫霉[7]。有报道西番莲果腐病由灰霉菌和菌核菌引起[4]。本研究证实在德宏州引起西蕃莲果腐病的是烟草疫霉，与广东省、福建省报道的一致，说明烟草疫霉在我国分布广泛，对西番莲的为害没有地域间差异。西番莲果腐病多发生于气温、湿度相对较高的雨季，病原菌烟草疫霉主要以游动孢子或孢子囊借助风雨或流水传播而暴发流行，高温高湿是其发生流行的主要环境因素。烟草疫霉是导致西番莲果腐的主要致病菌，该病菌也可造成大面积植株死亡，因此要控制西番莲果腐病的发生，应选择在通风良好、土层深厚的缓坡地建园，同时在种植管理上采取相应的措施：1）种植抗病品种，如相对抗病品种黄果西番莲;2）加固种植园中的棚架，减少风吹动对枝蔓、果实造成伤口;3）及时摘除病果，剪除染病枝叶和病死植株，并集中烧毁;4）在雨季做好田间管理，加强通风、土壤排水，多施有机肥、微生物菌肥，使根系生长旺盛，提高植株抗病性;5）及时控制害虫的为害，减少害虫对果实、枝蔓造成伤口;6）发病初期用甲霜灵、霜霉净、甲霜·锰锌等对病原菌有效的杀菌剂进行喷雾防治，每隔7～10 d喷施，连续喷2～3次，同时几种药剂交换使用，避免病菌产生抗药性。
　　参考文献：
　　[1] 方仲达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.
　　[2] 郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京：中国农业出版社，1995.
　　[3] White T J，Bruns T D，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M].New York：Academic Press，1990.
　　[4] 键渡德次.西番莲果腐病[J].亚热带植物通讯，1990（2）：67-68.
　　[5] Ho H H，Ann P J，Chang H S.The Genus Phytophthora in Taiwan[M].TaiPei：Institute of Botany，Aeademia Sinica，1995.
　　[6] 戚佩坤.广东果树真菌病害志[M].北京：中国农业出版社，2000.
　　[7] 西蕃莲病害研究课题组.西蕃莲疫病的研究[J].热带作物学报，1993，13（1）：75-78.
　　（责任编辑：刘昀）
　　收稿日期：2020-01-16
　　作者简介：李莉（1972—），女，湖南祁东人，本科，农艺师，研究方向为热带作物栽培技术推广。
　　※为通信作者，E-mail： 316606049@qq.com。
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