百合灰霉病病原菌鉴定及其部分生物学特性测定

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　　摘要：【目的】鑒定北京昌平地区百合灰霉病病原菌，并明确其生物学特性，为该病害的预测、防治及百合抗病育种提供理论依据。【方法】利用柯赫氏法则从东方百合索邦灰霉病病株中分离纯化获得致病菌，结合形态学及分子生物学方法鉴定病原菌种类;并利用菌落生长法和血球计数板孢子计量法研究病原菌的生物学特性。【结果】从索邦灰霉病叶片病斑上分离获得灰霉病病原菌（标记为CX1），利用形态学和分子生物学方法鉴定CX1菌株为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）。CX1菌株菌丝生长和产孢的最适培养基为PSA培养基，最适温度为20 ℃，最适光照环境为光暗交替（12 h光照/12 h黑暗），菌丝生长的最适pH为5～6，产孢的最适pH为6，菌丝生长和产孢的最适碳源分别为可溶性淀粉和蔗糖，最适氮源分别为牛肉膏和硫酸铵。【结论】引起北京昌平地区百合灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌。依据百合灰葡萄孢菌的生物学特性，生产中除使用化学和生物防治外，还可通过改变栽培环境、合理施肥、合理灌溉、合理密植、轮作等农业措施来抑制灰葡萄孢菌的生长和产孢，从而减轻病害发生。
　　关键词： 百合;灰霉病;病原菌鉴定;灰葡萄孢;生物学特性
　　中图分类号：S436.81                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0307-08
　　Abstract：【Objective】The present study was performed to identify the pathogen causing lily gray mold in Changping District， Beijing City， and to determine biological characteristics of the pathogen. The results would provide a scientific basis for forecasting， control and resistance breeding of lily gray mold. 【Method】The gray mold pathogen was isolated and purified from Lilium Oriental hybrid Sorbonne strains according to Koch’s rule and identified combining morphological characteristics study and molecular biological analysis. Biological characteristics of the pathogen were determined by measuring the diameter of the colony and counting the number of conidia using hemocytometer measurement. 【Result】The gray mold pathogen isolated from the pathogenetic lily leaves was marked as CX1. CX1 was identified as Botrytis cinerea Pers. according to morphological characteristics study and molecular biological analysis. For the mycelial growth and sporulation of CX1， the optimum medium was PSA， the optimum temperature was 20 ℃ and the optimum light condition was 12 h∶12 h alternation of light and darkness. The optimal pH value for mycelial growth and sporulation were 5-6 and 6， respectively. Soluble starch was the best carbon source and beef extract was the best nitrogen source for mycelial growth. The optimum carbon source and nitrogen source for sporulation were sucrose and （NH4）2SO4， respectively.  【Conclusion】The pathogen of lily gray mold occurs in Changping， Beijing was B. cinerea Pers. Based on the studies about biological characteristics of B. cinerea Pers.， apart from chemical and biological controls， growth of B. cinerea Pers. and sporulation can be inhibited by changing cultivation environment， reasonable fertilization， irrigation， planting density and rotation， so as to reduce the disease damage.
　　Key words： lily; gray mold; pathogen identification; Botrytis cinerea Pers.; biological characteristics 　　0 引言
　　【研究意义】百合（Lilium spp.）是百合科百合属球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。除传统药用、食用和提取香精外，百合花大色艳、花色多变、气味芳香，在我国被广泛栽培用作切花、盆花、园林绿化和专类园等（包满珠，2011）。但百合是一种较易感病的花卉，可发生真菌性病害、细菌性病害、病毒性病害、生理性病害和线虫病害等，其中发生面积较大、危害较严重的病害主要有灰霉病、枯萎病和病毒病，已成为遏制百合产业发展的重要因素之一。百合灰霉病又称叶枯病，主要危害百合的叶、茎和花，导致叶片枯死、花器褐腐、茎秆发黑和鳞茎停止生长，严重影响切花及种球的产量和质量（朱丽梅等，2011）。因此，鉴定百合灰霉病病原菌，研究其生物学特性，对百合灰霉病预测、防治及抗病品种选育等均具有重要意义。【前人研究进展】引起江西、江苏南京、甘肃兰州和广西永福地区百合灰霉病的致病菌为椭圆葡萄孢[Botrytis elliptica（Berk.） Cooke.]（唐祥宁等，1998;朱丽梅等，2010;白滨等，2013;仇硕等，2018）。椭圆葡萄孢孢子萌发的最适温度为l5～20 ℃，相对湿度90%～100%时发病潜育期为20～24 h，2 d后进入盛发期（唐祥宁等，1998）。不同品种对百合灰霉病的抗性存在差异，法兰西和罗蒂娜为高感品种，康斯坦萨和索邦为高抗品种（朱丽梅等，2010）。深绿木霉蛋白质TraT2A能够诱导兰州百合对灰葡萄孢的抗性（梁巧兰等，2017）。Cao等（2018）首次鉴定灰葡萄孢（B. cinerea）为百合（铁炮百合）葉枯病病原菌。目前，针对百合灰葡萄孢菌生物学特性的研究尚未见报道。【本研究切入点】近年来，北京市昌平区温室栽培的东方百合索邦和西伯利亚等品种灰霉病发生严重，影响了切花的产量和质量，造成较大的经济损失，但尚无针对该地区主栽东方百合灰霉病病原菌鉴定及生物学特性等的相关研究报道。【拟解决的关键问题】采集北京市昌平区东方百合杂种系索邦的灰霉病病株，采用常规组织分离法分离病原菌，结合形态学和分子生物学鉴定病原菌种类，并对病原菌在不同培养条件下的菌落直径和产孢量等生物学特性进行研究，以期为该病害的预测、防治和百合抗病育种打下理论基础。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　供试材料为具有典型灰霉病症状的东方百合杂种系（Lilium Oriental hybrids）索邦（Sorbonne）病株，采集自北京市昌平区李村百合生产合作社。
　　1. 2 试验方法
　　1. 2. 1 病原菌鉴定
　　1. 2. 1. 1 病原菌分离与纯化 无菌水冲洗具有典型灰霉病症状的百合叶片，于超净工作台内切取病健交界处组织，剪成5 mm×3 mm小块，用75%酒精浸泡1 min，0.1%氯化汞浸泡30 s，无菌水冲洗3次。采用组织分离法，于PDA培养基上20 ℃培养，采用单孢分离法纯化（方中达，2007）。
　　1. 2. 1. 2 致病性测定 孢子接种测定：用无菌水配制菌株孢子悬液，将菌悬液喷洒于健康的盆栽索邦叶片背、腹面，以喷洒无菌水为对照。于人工气候室22 ℃保湿培养，逐日观察症状，及时记录发病情况并拍照。
　　菌饼接种测定：菌株在PDA培养基上培养7 d后，用打孔器取直径7 mm的菌饼，用消毒的订书钉将菌饼固定于健康的盆栽索邦叶片中央，以贴PDA片为对照。每处理3株，3次重复。于人工气候室22 ℃保湿培养，及时观察发病状况并拍照。
　　根据柯赫氏法则，从接种发病的百合叶片再次分离纯化致病菌。
　　1. 2. 1. 3 形态与分子鉴定 形态鉴定：将分离纯化的菌株在PDA培养基上20 ℃培养3 d，待菌丝快长满培养基时观察菌落特征。同时用水作为浮载剂，用OLYMPUS BX51显微镜观察菌丝和孢子形态并拍照。
　　分子生物学鉴定：使用D3390-02 Fungal DNA Kit试剂盒（Omega Bio-Tek公司）提取菌株基因组DNA。利用PCR扩增rDNA-ITS序列及HSP60、G3PDH和RPB2等基因（Cao et al.，2018）。所得基因序列在NCBI网站用BLAST进行比对分析，利用MEGA 5.0构建系统发育进化树。
　　1. 2. 2 病原菌的生物学特性研究 将直径为7 mm的病原菌菌饼分别接种于供试培养基（d=90 mm）中央，置于培养箱中培养，研究培养基种类、温度、光照、pH、碳源和氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响。
　　1. 2. 2. 1 不同培养基对菌丝生长和产孢量的影响 供试培养基分别为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、改良沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（mSDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、马铃薯麦芽糖琼脂培养基（PMA）、察氏培养基（CDA）和基础培养基（BM）等6种固体培养基。
　　1. 2. 2. 2 不同温度、光照、pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 培养温度设5、10、15、20、25、30和35 ℃ 7个处理;光照条件设全光照、光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）和全黑暗3个处理;pH设3、4、5、6、7、8、9、10、11和12等10个处理。
　　1. 2. 2. 3 不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 以CDA培养基为基础培养基，将蔗糖分别用等量的葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉和微晶纤维素代替，制成不同碳源培养基，以无碳源培养基为对照;以CDA培养基为基础培养基，将硝酸钠分别用等量的硫酸铵、氯化铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、甘氨酸和天门冬酰胺代替，制成不同氮源的培养基，以无氮源培养基为对照。
　　试验中若无特殊说明，培养条件均为PDA培养基、20 ℃、全黑暗。每处理3次重复。培养76 h后采用十字交叉法测量菌落直径，88 h后采用血球计数板法测量孢子量。 　　1. 3 统计分析
　　利用Excel 2007和SPSS 18.0处理分析试验数据。
　　2 结果与分析
　　2. 1 百合灰霉病病原菌的分离鉴定结果
　　2. 1. 1 病原菌的分离与形态鉴定 从索邦灰霉病叶片病斑上分离纯化获得的菌株（标记为CX1）培养性状和形态特征表现为：在PDA培养基上20 ℃培养，菌落圆形、疏松，生长较快，培养3～4 d即可长满培养基;气生菌丝绒毛状，初期白色，后转灰色（图1-A和图1-B）;培养后期可见黑色菌核;菌丝具隔，不规则分支，分支处有隘缩（图1-C）;分生孢子梗细长，无色，有隔膜，顶端细胞膨大成球形，上面有许多小梗;分生孢子单胞，无色，椭圆形，着生小梗上聚集成葡萄穗状（图1-D和图1-E）。根据培养性状和菌丝、孢子形态，初步鉴定CX1菌株为灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）。
　　2. 1. 2 致病性测定 将CX1菌株接种到索邦植株上进行致病性测定。孢子接种7 d，植株上部叶片出现红褐色小点，逐渐扩大呈圆形或椭圆形，中央灰白色，边缘红褐色，病斑变薄而脆，半透明状。叶缘与叶尖发病时，叶枯现象更严重（图2-A）。菌饼接种3 d，叶片出现红褐色病斑，初为圆形，后扩大呈椭圆形或不规则形，病斑变薄而脆，半透明状，由于针孔导致崩裂（图2-B）。室内活体接菌引起的病症与田间症状基本一致。从发病组织上再次分离纯化致病菌，在PDA培养基上的培养性状及菌丝、孢子特征均与原接种菌株一致。根据柯赫氏法则，表明原接种菌株为病原菌。
　　2. 1. 3 病原菌分子生物学鉴定 用ITS1和ITS4作引物对，对CX1菌株进行rDNA-ITS序列扩增。测得该序列长度为539 bp，与灰葡萄孢菌或富克葡萄孢盘菌（Botryotinia fuckeliana）的同源性为100%（图3-A）。对HSP60、G3PDH和RPB2等基因的测序结果表明，CX1菌株与灰葡萄孢菌的同源性均为100%（图3-B）。结合形态特征，可鉴定东方百合索邦灰霉病病原菌为灰葡萄孢菌（B. cinerea Pers.）。
　　2. 2 百合灰霉病病原菌灰葡萄孢菌生物学特性
　　2. 2. 1 不同培养基对CX1菌株菌丝生长和产孢量的影响 表1结果表明，不同培养基对CX1菌株菌丝生长和产孢量的影响显著（P<0.05，下同）。CX1菌株在PSA培养基上生长最快，培养至第76 h，菌落直径为7.30 cm;在BM培养基上的菌落直径最小，为4.12 cm，且菌丝极稀疏。培养至第88 h，CX1菌株在PSA培养基的产孢量最多，为2.83×106个/皿，其次为PMA和PDA培养基，在CDA和mSDA培养基上的产孢量较少，在BM培养基上的产孢量最少。因此，CX1菌株菌丝生长和产孢的最适培养基为PSA培养基。
　　2. 2. 2 不同温度、光照和pH对CX1菌株菌丝生长和产孢量的影响 表2结果表明，温度过低（5 ℃）或过高（30～35 ℃）均可显著抑制CX1菌株的菌丝生长和产孢。15～25 ℃为CX1菌株菌丝生长的适宜温度，最适温度为20 ℃;产孢的适宜温度为20～25 ℃，最适温度为20 ℃。CX1菌株菌丝在光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）条件下生长最快，与全光照处理相比，菌落直径差异不显著（P>0.05），但显著高于全黑暗处理。光暗交替条件下产孢量最多，显著高于全光照或全黑暗環境。CX1菌株在pH 3～10范围内均可生长，在pH 4～8时生长较快，最适pH为5～6;随着pH的增大，产孢量呈先增加后减少的趋势，当pH为5～7时产孢量较高，pH为6时产孢量最高。
　　2. 2. 3 不同碳源和氮源对CX1菌株菌丝生长和产孢量的影响 由表3可看出，CX1菌株在无碳或无氮培养基上均能生长，但菌丝极稀疏。与对照相比，添加不同碳源促进了菌丝的生长;最适宜菌丝生长的碳源为可溶性淀粉，其次为果糖和葡萄糖等，微晶纤维素效果最差;以蔗糖为碳源的培养基产孢量最多，其次为葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉，海藻糖和微晶纤维素的效果较差。与对照相比，在培养基中添加尿素、甘氨酸、氯化铵或天门冬酰胺等抑制了菌丝的生长;菌丝在以牛肉膏为氮源的培养基中生长最快，其次为酵母浸膏和蛋白胨，表明灰葡萄孢菌对上述有机氮的利用效果较好;以氯化铵或硫酸铵等铵态氮为氮源时菌丝生长较慢，但产孢量最多。
　　3 讨论
　　依据致病性和形态特征，鉴定江西、江苏南京、甘肃兰州及广西永福地区百合灰霉病及百合叶枯病的致病菌为椭圆葡萄孢（唐祥宁等，1998;朱丽梅等，2010;白滨等，2013;仇硕等，2018）。椭圆葡萄孢菌丝生长的适宜温度为20～25 ℃，孢子萌发的适宜温度为l5～20 ℃，萌发时需要较高的相对湿度（唐祥宁等，1998;白滨等，2013）。椭圆葡萄孢以菌丝体和菌核在病株和土壤中越冬，翌年春天，菌丝体和菌核产生分生孢子，通过风、雨传播到植株上形成初侵染，条件适宜可发生多次再侵染。在冷凉、多湿的环境下，病菌可产生大量分生孢子，引起病害流行（瞿友均和徐源辉，2010）。近年来，北京市昌平区的温室观赏百合生产基地由于多年连作，百合灰霉病逐年加重，冬季阴雨天病害尤为严重，本研究运用形态学结合分子生物学方法鉴定该地区主栽的东方百合索邦灰霉病病原菌为灰葡萄孢，该菌也能引起铁炮百合发生叶枯病（Cao et al.，2018）。为便于病害的流行预测和防治，本课题组进一步研究了灰葡萄孢菌的生物学特性，结果显示，灰葡萄孢菌CX1菌株生长和产孢的最适培养基为PSA培养基，与袁月等（2016）对人参灰葡萄孢PJAR1和PJAL3等菌株的研究结果相近，而海棠灰霉病菌在PDA培养基上生长及产孢速度较快（刘春元等，2003）。巩慧玲等（2015）对Aspergillus flavus和Rhizopus oryzae的研究表明，两种病原菌在百合培养基和百合葡萄糖培养基上菌丝生长和产孢量显著高于PSA、PDA和PMA等培养基，该结果对今后的研究有借鉴意义。CX1菌株菌丝生长和产孢的最适温度为20 ℃，与越橘灰霉病病原菌灰葡萄孢菌的生物学特性一致（陈长卿等，2012），高于30 ℃时，菌丝生长和产孢受到严重抑制，与灰霉病在低到中温迅速传播蔓延的发病规律相吻合（罗长维和陈友，2018）。全黑暗条件有利于玫瑰灰葡萄孢菌的生长（张悦等，2015），但本研究发现百合灰葡萄孢菌在全黑暗条件下的生长速率显著低于光暗交替和全光照环境。百合灰葡萄孢菌在偏酸环境中（pH 5～6）生长较快，与报道的玫瑰（张悦等，2015）、越橘（陈长卿等，2012）、香葱（李聪丽等，2017）等其他植物的灰霉病菌生物学特性基本相同。分离自葡萄的灰葡萄孢菌在以蛋白胨为氮源时，其菌丝生长和产孢量均显著高于甘氨酸、硫酸铵和尿素等氮源（高智谋等，2009），最利于香葱灰葡萄孢菌生长的碳源是可溶性淀粉（李聪丽等，2017），蔗糖和葡萄糖均能较好地促进灰葡萄孢菌产孢（王丹，2008），本研究也得到相似的结果。氯化铵和硫酸铵等铵态氮最不利于烟草灰葡萄孢分生孢子的形成，本研究得到相反的结论，即以氯化铵或硫酸铵为氮源有利于百合灰葡萄孢菌产孢。以上的研究结果表明，灰葡萄孢菌的生物学特性随寄主的不同而异。本研究仅探讨了灰葡萄孢菌菌落直径和产孢量两个指标，具有一定的局限性，今后应进一步研究各因素对孢子萌发、致死温度、菌核形成等的影响，以期为百合灰霉病的预测和防治提供更多理论依据。除病原菌的鉴定及生物学特性研究外，对百合灰霉病的研究还涉及病害发生规律及综合防治（瞿友均和徐源辉等，2010）、化学与生物防治（Chiou and Wu，2003;刘树芳等，2006;朱丽梅等，2011;梁巧兰等，2017）、抗病种质资源（朱丽梅等，2010;杜运鹏，2014）及抗病机制（韩青等，2015;宋翔宇，2016）等，本课题组下一步的研究工作聚焦在百合灰霉病的生物防治与抗病关键基因的发掘方面。 　　4 结论
　　引起北京昌平地区百合灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌（B. cinerea Pers.）。百合灰葡萄孢菌菌丝生长和产孢的最适培养基为PSA培养基，最适温度为20 ℃，最适光照环境为光暗交替（12 h光照/12 h黑暗），菌丝生长的最适pH为5～6，产孢的最适pH为6，菌丝生长和产孢的最适碳源分别为可溶性淀粉和蔗糖，最适氮源分别为牛肉膏和硫酸铵。依据百合灰葡萄孢菌的生物学特性，生产中除使用化学和生物防治外，还可通过改变栽培环境、合理施肥、合理灌溉、合理密植、轮作等农业措施来抑制灰葡萄孢菌的生长和产孢，从而减轻病害发生。
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