氧化应激损伤中NKFB1基因多态性对细胞凋亡的影响
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摘 要：目的：人原代脐静脉内皮细胞（HuvECs）通过氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导从而建立体外氧化应激损伤模型，观测NF-κB1基因启动子区-94号位点ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）对细胞凋亡的影响。方法：检测ox-LDL对细胞活性影响的适宜时间及浓度，并通过ox-LDL诱导HUVECs建立氧化应激损伤模型，通过Western blot法分别检测空白对照组及ox-LDL诱导组NFKB1不同基因型的细胞凋亡情况。结果：MTT结果显示：HuvECs通过100umol/L ox-LDL诱导12h细胞活力即可显著降低;Western blot检测结果显示：ox-LDL可诱导HuvECs发生细胞凋亡，且DD型凋亡水平较II型显著增高。结论：ox-LDL诱导HUVECs可促使细胞发生凋亡，且NFKB1不同基因型中细胞凋亡水平具有显著差异。
关键词：NFKB1;氧化应激;冠心病;凋亡
1 研究背景
冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease，冠心病）是60岁以上人群的首要死亡原因。炎症反应是冠心病发生发展的核心机制，其中NF-κB信号通路处于炎症反应的中心环节，因而冠心病的发生发展与NF-κB1基因启动子区-94号位点ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）密切相关，但多数研究仅进行了大样本人群筛查工作，并未对其产生机制进行进一步探索研究。基于此，本研究拟通过检测NF-κB1基因启动子区多态性，观测不同基因型细胞间的凋亡水平差异，从而通过筛查个体基因类型提高冠心病的早期诊断能力，同时为易感个体提供个体化治疗，降低其心血管疾病的并发症、死亡率提供理论基础。
2 研究方法
2.1 材料
M199培养基、胰蛋白酶购自HyClone公司，胎牛血清购买于杭州四季青生物工程系有限公司，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）购自广州奕源生物科技有限公司，MTT购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司公司，兔抗人BCL-2、BAX抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。脐静脉内皮细胞取自新疆医科大学第一附属医院。
2.2 方法
2.2.1 氧化应激损伤模型建立及分组
将HUVEC细胞在37℃、5%CO2条件下进行培养，96孔板5000细胞/孔进行铺板，分别加入0、50、100、150umol/L ox-LDL刺激HUVEC 0、4、8、12、24h。培养结束后去除孔内培养基，每孔加入200ul浓度为100ng/ml MTT的完全培养基，培养4h后去除培养基，每孔加入100ul DMSO，震荡10min后酶标仪495nm检测吸光值。根据所得数据，选择最适浓度及时间对不同基因型HUVECs进行分组诱导。实验分为空白组和ox-LDL诱导组，各组再根据HuvECs的NFKB1基因型分组，分别为：DD型组、II型组。
2.2.2 NFKB1基因多态性在细胞凋亡的影响
分别收集四组细胞，提取细胞蛋白，通过BCA法进行蛋白定量检测。Western Blot法分别检测凋亡相关蛋白：BAX、BCL-2表达水平。电泳中每道蛋白上样体积为10ul：分别包含蛋白10ug，5×上样缓冲液2ul，剩余体积用蛋白裂解液补足;结束后采用电转法将蛋白转至PVDF膜上;转模后，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h;0.05ml/L TBST洗膜;再分别加入1∶1000稀释的兔抗人BAX、BCL-2抗体，4℃孵育过夜;TBST洗膜;加入1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔二抗，室温孵育2h;TBST洗膜;加入BCIP/NBT显色。以BCL-2/BAX的吸光度比值进行半定量分析。
3 结果
3.1 氧化应激损伤模型建立
MTT结果显示：100umol/L ox-LDL诱导12h可显著降低细胞活性，使细胞发生氧化应激损伤反应，因此后续实验采取此诱导浓度及诱导时间建立模型。
3.2 NFKB1基因多态性对细胞凋亡的影响
Western Blot检测结果显示：各组细胞蛋白提取物中BAX及BCL-2蛋白均有表达，且ox-LDL诱导组凋亡水平显著高于空白对照组，其差异存在统计学意义（P<0.05）;通过分析ox-LDL诱导组内DD型、II型亚组BAX与BCL-2比值结果发现：II型HuvECs凋亡水平远低于DD型，其差异存在统计学意义（P<0.05）。Western Blot檢测结果表明：ox-LDL可诱导HuvECs产生凋亡，且NFKB1 II型细胞凋亡水平显著低于DD型。
4 讨论
本实验通过对HuvECs采用ox-LDL诱导建立体外氧化应激损伤模型，在此次基础上明确了体外氧化应激损伤模型中NF-κB1-94ATTG ins/del不同基因型在细胞凋亡中的影响，其结果表明：与突变纯合子DD型相比，纯合子II型具有较低的细胞凋亡水平。
综上所述，本研究证实了氧化应激损伤中NFKB1基因多态性对细胞凋亡的重要意义，为今后冠心病的早期诊断和个体化治疗提供了理论依据。
参考文献：
[1]Juraschek SP，Bower JK，Selvin E，et al.Plasma lactate and incident hypertension in the atherosclerosis risk in communities study[J].Am J Hypertens.2015，28（2）：216-224.
[2]Yang YN，Zhang JY，Ma YT，et al.-94 ATTG insertion/deletion polymorphism of the NFKB1 gene is associated with coronary artery disease in Han and Uygur women in China[J].Genet Test Mol Biomarkers.2014，18（6）：430-438.
项目：陕西省教育厅专项科研计划项目（18JK0679）
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