陈化烟叶细菌区系的高效分离及增殖技术研究

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　　摘  要：对陈化烟叶的细菌区系进行高效分离及扩增，获得最适助分离剂和分离条件，选取在玉溪陈化，等级为WDC3F的K326烟叶为试验材料，使用4种不同的助分离剂对陈化烟叶细菌区系进行了分离，同时对分离的细菌区系进行了培养增殖，利用可培养和免培养法对培养前后的细菌区系多样性进行了评价和分析。结果表明，以1‰ SDS为助分离剂对陈化烟叶细菌区系进行分离，分离率相对于传统方法提高了489.58%。培养温度为15 ℃时，使用烟叶浸液培养基不仅可使烟叶表面细菌总量增殖约100倍，而且可以较好地保留区系的多样性。免培养分析表明，培养增殖前后的细菌区系结构存在一定差异，但其细菌群落代谢功能并没有显著差异，这表明扩增后的细菌区系仍然具备了原细菌区系的生理功能。本研究探索并建立了陈化烟叶细菌区系的高效分离方法，为陈化烟叶微生物资源的开发提供了理论基础。
　　关键词：细菌区系;陈化烟叶;分离;增殖;分析
　　Isolation and Amplification of the Microbiota from Aging Tobacco Leaves
　　YIN Shuang1， SUN Wanwan1， WANG Yi2， JI Xiuling1， ZHANG Qi1， WEI Yunlin1*
　　（1. Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China; 2. Technology Center， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650231， China）
　　Abstract： In order to collect microbiota efficiently from tobacco leaves during aging process and obtain the most suitable separating agent and conditions. The K326 toabacco with WDC3F grade from Yuxi area were used as the experimental material in this study. The bacterial floras of aging tobacco leaves were collected by using four separation solutions. Meanwhile， the collected bacterial flora was cultured and amplified. The bacterial flora diversity was also evaluated before and after the culture using culturable and non-culturable analysis. The results showed that an effective method for collecting microbiota of aging tobacco leaves with 1‰ SDS as a helper in separation solution was found that the collection rate was increased by 489.58% compared with the traditional method.， The tobacco leaf infusion medium supplemented with tobacco leaf extract could not only increase the total number of bacterial flora by 100 folds， but also preserve the flora diversity under the culture condition of 15 ℃. The results by non-culturable analysis showed that the structures of bacterial flora in amplified sample were changed， but there was no significant differences in the bacterial community metabolic function， which indicated that the amplified bacterial flora kept the same physiological functions as original bacterial flora. So， this study established an efficient collection and amplification method for the bacterial flora from aging tobacco leaves， which provided a basis for the development of aged tobacco leaf microorganism resources.
　　Keywords： microbiota; aging tobacco; microbiota collection; proliferation of bacterial biota; analysis of bacterial biota
　　陳化烟叶表面存在着大量的微生物，包括细菌、真菌和少量放线菌，它们所组成的微生物群落称为“陈化烟叶微生物区系”[1-4]。研究表明微生物区系是烟叶陈化主要的生物因素之一，可通过多个途径调节烟叶陈化过程，最终使陈化烟叶的内在品质得到改善，更加符合人们的使用需求[5-6]。微生物区系在陈化植物中起着重要作用。 　　从自然陈化的烟叶表面分离得到的微生物区系中，细菌是主要组成成分，真菌及其他微生物在陈化过程中作用十分有限。部分功能性细菌在陈化植物中的作用受到人们的关注，但从细菌区系角度进行系统研究的少见报道[7-8]。植物在生长过程中产生非常复杂的次生代谢产物，后期经过陈化会使其转化得更复杂，这些都影响着植物陈化过程中微生物区系的组成与分离[9-12]。目前细菌区系分离方法主要采用分步离心法和超声破碎法。分步离心法会导致样品悬浮液中的可培养微生物种类减少，超声破碎法则会随着超声波振荡时间的延长造成溶液中的微生物量变化，这两种方法均不能完整的分离获得陈化烟叶表面的细菌区系[13-15]。如何高效分离和系统分析陈化烟叶细菌区系是亟待解决的问题。
　　本研究选用在玉溪进行陈化等级为WDC3F的K326烟叶为材料，通过在分离液中添加不同助分离剂，探索助分离剂的最适浓度以及分离条件，为陈化烟叶细菌区系的高效分离提供理论依据，并为烟叶微生物资源开发提供一定的理论基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　于2018年9—10月，采集云南省玉溪市研和县（24°8′36″N，102°28′30″E，平均海拔2100 m）陈化等级为WDC3F的K326烟叶。
　　1.1.1  试验试剂与仪器  Mix，通用引物等由北京硕擎公司合成;16S rRNA回收试剂盒，GeneJET胶回收试剂盒，吐温20均购自索莱宝公司;Trizol，玻璃珠（直径0.1 mm）购自Ambion公司;基因组提取试剂盒使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）。其他化学试剂均为国产分析纯。
　　1.1.2  试验培养基  LB 培养基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。PYGV培养基：Tryptone 0.25 g，酵母粉 0.25 g，25%葡萄糖 10 mL，维生素溶液 5 mL，无机盐溶液 20 mL，定容于1 L。烟叶浸液培养基：酵母粉 0.5 g，胰蛋白胨 1 g，NaCl 1 g，以烟叶浸出液（取10 g烟叶用250 mL蒸馏水浸提30 min，过滤后灭菌）定容于1 L。
　　1.2  试验方法
　　1.2.1  陈化烟叶细菌区系的分离及优化  据文献[26]方法分离，具体如下：称取玉溪陈化等级为WDC3F的K326烟叶10 g，剪碎（1×1 cm）后移至装有250 mL的分离液（NaCl 8.5 g/L，121 ℃灭菌15 min）的三角瓶中。经摇床振荡、过滤、离心后等梯度稀释涂布，通过平板计数法进行计数。以上述分离液为对照，往三角瓶中分别加入1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的SDS（m/V），研究不同浓度SDS对分离陈化烟叶细菌区系的影响;分别加入1‰（m/V）SDS、25颗玻璃珠、1%（m/V）吐温20以及1%（m/V）Trizol，研究不同助分离剂对分离细菌区系的影响。
　　 将分离液进行等梯度稀释，通过平板计数法计数。同时观察菌落形态并进行菌落种属鉴定。
　　1.2.2  陈化烟叶细菌区系的增殖培养及培养基筛选  分别取100 L的分离液于不同的培养基中按表1方式培养后，通过平板计数法计数并进行菌落种属鉴定。
　　1.2.3  细菌区系的种属鉴定  采用基因组提取试剂盒提取陈化烟叶表面微生物区系的总DNA，扩增16S rDNA基因序列（通用引物：515F，5'-ATACTATGATACTGGCTCCA-3'，806R，
　　5'-AGTTACGTTGCTACGACAT-3'），切胶回收后送云南同创检测技术股份有限公司进行宏基因组测序、鉴定种属。
　　1.2.4  陈化烟叶免培养细菌多样性分析  根据所扩增区域的特点，基于IonS5TMXL测序平台，构建文库。通过剪切、OTUs聚类，随后进行物种注释及丰度分析，揭示样品物种构成;α多样性分析（Alpha Diversity）揭示样品之间的差异。
　　1.3  数据分析方法
　　 采用生物信息學软件PICRUST数据处理系统和Microsoft Excel 2010软件对数据进行分析。
　　2  结  果
　　2.1  不同助分离剂对陈化烟叶细菌区系的分离效果
　　2.1.1  不同浓度SDS分离效果  由图1可知，不加SDS处理分离获得细菌总量为0.48×103 cfu/g。在分 离液中加入1‰的SDS溶液时分离效果最好，分离获得细菌总量为2.83×103 cfu/g，比对照组分离获得细菌总数提高约5倍（489.58%）。而其他浓度SDS溶液也有助于细菌总数的提高。
　　2.1.2  不同种类助分离剂分离效果  由图2可知，不同助分离剂对分离获得细菌总量影响极显著，同对照相比，1‰ SDS效果最佳、次之为玻璃珠（细菌总数提高104.57%）以及1%吐温20（细菌总数提高19.94%），而1% Trizol具有抑制细菌生长的作用，致使细菌总数低于对照组。
　　2.2  陈化烟叶可培养细菌鉴定
　　2.2.1  烟叶表面可培养细菌区系的菌落形态  培养12 h后，根据菌落的形态、颜色、大小等特征将群落分类、计数，统计结果见表2。由表2可知，菌落以圆形为主，菌落颜色主要为乳白色，部分为黄色，少量为无色，最大菌落直径为4 mm，最小菌落直径为1 mm。
　　2.2.2  烟叶表面可培养微生物区系的种属鉴定  烟叶可培养细菌区系的菌种鉴定结果见表3。16个样品经过16S rDNA序列基因比对后鉴定为6种菌，其中2和9号菌为克氏杆菌（Bacillus kochii），分离到的有效浓度为1×102 cfu/g;编号3，4，5，14为赫氏亚特兰德杆菌（Atlantibacter hermannii），分离到的有效浓度为4.5×103 cfu/g;编号1，6，7，10，15为枯草芽孢杆菌（B. subtilis），分离到的有效浓度为1.5×103 cfu/g;编号11为蜡样芽胞杆菌（B. cereus），分离到的有效浓度为50 cfu/g;编号8，12，13为B. aquimaris，分离到的有效浓度为6.84×102 cfu/g;编号16为B. megaterium，分离到的有效浓度为17 cfu/g。 　　6种菌分别属于2个属，即为芽孢杆菌属（Bacillus）和亚特兰杆属（Atlantibacter），由此可见，该陈化时期的烟叶表面可培养微生物的优势菌种类比较单一。
　　2.3  陈化烟叶细菌区系在不同培养基上的增殖效果
　　由表4可知，不同培养温度下，随着培养时间延长，经过LB培养基培养后，细菌区系的增殖数量最高，烟叶浸液培养基次之，细菌在PYGV培养基上不能生长。在15 ℃培养8 h，细菌区系经过LB培养基和烟叶浸液培养基培养后，其细菌种类数量略有降低，培养至12 h，经过LB培养基培养的细菌种类数量再次降低，而在37 ℃培养8 h和12 h，细菌种类数量降低了33.33%。
　　 综合而言，在优先保证促陈化菌种库多样性的前提下，在15 ℃使用烟叶浸液培养基培养12 h来培养烟叶细菌区系，总微生物的数量提高了100倍左右，增殖效果较好。
　　经鉴定，陈化烟叶细菌区系经烟叶浸液培养基培养后获得5种菌（表5），即克氏杆菌（B. kochii）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡样芽胞杆菌（B. cereus）、B. aquimaris和赫氏亚特兰德杆菌（A. hermannii），有效浓度依次为1.03×104、4.53×105、1.39×105、6×105以及7.2×104 cfu/g。该结果与扩增前种属（表3结果）相比，扩增后未获得菌B. megaterium，细菌量总数提高约100倍，而细菌相对丰度和多样性无明显变化。
　　2.4  陈化烟叶免培养和可培养细菌多样性分析
　　2.4.1  OTUs聚类及物种注释  表6所示，未经过增殖培养的陈化烟叶微生物Q.1经过宏基因测序得到的OTUs数目为91条，增殖培养之后的微生物H.1得到的OTUs数目为21条，这说明未经过增殖培养的陈化烟叶微生物具有较高的丰富度，增殖培养之后具有较低的丰富度。
　　2.4.2  群落结构分析  在门水平上，各物种相对丰度如图3。由图3可知，未经过增殖培养的陈化烟叶微生物（Q.1）群落在门分类水平上包括变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）以及少量的放线菌（Actinobacteria），培养之后的微生物（H.1）群落仅仅只包含变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。通过对比发现，变形菌门在样品细菌群落中占据主导地位，为最优势细菌。
　　2.4.3  群落功能相对丰度分析  根据数据库注释结果，选取每个样本或分组在各注释层级上最大丰度排名前10的功能信息，生成功能相对丰度柱状堆积图，如图4所示。由图4可知，未经过培养增殖的陈化烟叶微生物（Q.1）和培养增殖之后的微生物（H.1）群落功能相对丰度与比例没有明显的差异。陈化烟叶微生物的功能基因主要包括：与膜转运相关的基因、碳水化合物代谢相关的基因、氨基酸代谢相关的基因、复制和修复相关的基因、与细胞过程和信号传递相关的基因、能量代谢相关基因、辅助因子和维生素代谢相关基因、翻译相关基因、脂质代谢相关基因以及一些其他功能的相关基因。
　　3  讨  论
　　本研究发现添加1‰ SDS分离K326陈化烟叶表面微生物区系的效果最好。SDS是离子型表面活性剂，本身所带的电荷可以降低微生物与灰尘颗粒或者植物之间的作用力，并且SDS具有良好的去污能力，可以溶解烟叶陈化过程中生成的油脂等黏性物质，从而有助于微生物的分离[16-17];Trizol主要成分是苯酚，作为提取RNA的裂解剂能够使细胞的蛋白、核酸等物质得到释放[18]，但是在提取过程中，Trizol也会使微生物发生死亡性裂解，导致微生物数量减少。吐温20作为溶质的助悬剂，能够中和化学试剂对微生物的抑制作用，但是其本身的不
　　饱和脂肪酸也十分容易氧化降解而产生多种有毒成分导致微生物数量减少[19]。玻璃珠在振荡过程中能使微生物从烟叶表面分离下来，但是玻璃珠对细胞具有机械破碎作用，导致分离效率不高。此外，本研究仅对陈化烟叶表面的好氧细菌进行了分离，而对于陈化烟叶表面存在的厌氧菌值得在后续试验中进行深入研究。
　　在不同培养温度下，经过LB培养基培养之后，陈化烟叶细菌区系的丰度最高，烟叶浸液培养基次之，PYGV培养基最低;而经过烟叶浸液培养基培养之后，微生物的多样性最高，LB培养基次之，PYGV 培养基最低。造成这种现象可能是：不同培养基的营养配比不同。有研究表明，营养丰富的培养基更有利于优势菌的富集，但贫培养基有利于微生物多样性的保持[20-21]。相比较而言，LB培养基营养最为丰富，烟叶浸液的营养成分次之，PYGV培养基营养最低，这一结果与其他报道也较为相似[22]，但是有些区别，造成这一区别的原因是PYGV培养基的营养非常匮乏，短时间内无法满足不同细菌的快速增殖。
　　通过微生物可培养技术对陈化烟叶细菌区系的多样性和丰度进行研究。结果表明，陈化烟叶细菌区系培养增殖前主要为芽孢杆菌属和亚特兰杆属，这与其他学者的研究結果一致。浦绍占等[23]和韩锦峰等[24]发现，随着陈化过程的进行芽孢杆菌属逐渐成为优势菌，培养增殖之后主要优势菌是芽孢杆菌属和亚特兰杆属，可以看出，在属水平上，陈化烟叶细菌区系培养增殖前后细菌群落的多样性无变化，从种水平上来看，陈化烟叶细菌区系培养增殖后与陈化烟叶细菌区系培养增殖前相比，也只缺失了Bacillus megaterium。
　　同时通过微生物免培养技术对陈化烟叶细菌区系的多样性和丰度进行研究，发现虽然陈化烟叶培养增殖前后细菌区系的多样性和丰度存在差异，但在代谢功能上却没有显著差异。未经过培养增殖的陈化烟叶微生物群落在门分类水平上包括了变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）以及少量的放线菌（Actinobacteria），培养增殖之后的微生物群落仅仅只包含变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。变形菌门在样品细菌群落中占据主导地位，为最优势细菌，这与其他人的研究结果相似[13，25-26]。值得注意的是，本研究仅对有限的试验样品进行了分析，在后续试验中应该采集不同地点的陈化烟叶进行研究，为试验提供更完善的理论依据。 　　4  结  论
　　研究表明，以1‰ SDS为助分离剂相对于传统方法对陈化烟叶细菌区系的分离率提高了489.58%。免培养分析表明，培养增殖前后的细菌区系组成存在一定差异，但其代谢功能并没有显著差异，培养增殖后的细菌区系仍然具备了原细菌区系的生理功能。使用烟叶浸液培养基培养可使烟叶表面可培养细菌增殖约100倍，并能较好地保留区系的多样性。研究为合理利用微生物区系促进烟叶陈化提供了应用基础。如何使微生物区系更完整地分离并在不影响其群落结构和功能完整性的前提下得到高效增殖，仍然值得进一步探索。分离和培养增殖的细菌在烟叶陈化过程中的应用也有待进一步验证。
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　　用生物酶制剂开发研究”（S-6013067）
　　作者简介：殷  爽（1995-），男，硕士研究生，从事烟草微生物生态与应用研究。E-mail：448148935@qq.com。*通信作者，E-mail：homework18@126.com
　　收稿日期：2019-08-26                       修回日期：2020-02-12
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