不同白蜡品种的DNA指纹图谱特征研究
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摘 要：通过构建DNA指纹图谱，从DNA分子水平鉴定区分大叶白蜡（对照）、大叶白蜡伊犁1号、金叶白蜡，为探究构建白蜡种质资源的方法提供了坚实的理论依据。利用来自白蜡的11对SSR多态性引物对2个普通白蜡品种进行了PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并构建白蜡DNA指纹图谱，将11份白蜡种质完全区分。这些SSR标记所构建的白蜡的指纹图谱，不受表型特征限制，也不受外部环境影响，不仅可用于白蜡品种的鉴定，还可为白蜡品种的杂合性鉴定提供可靠的技术，为白蜡良种审认定、分子标记辅助育种等方面奠定理论基础。
关键词：白蜡;SSR标记;指纹图谱
中图分类号：S-3 文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530019
白蜡树是我国分布广泛的一种常见耐盐碱的绿化树种[1]。白蜡（Fraxinus sp.）属双子叶植物纲，木犀科（Oleceae），是木犀亚科（Oleoideae）植物的通称，又称梣（chén）。白蜡喜光，稍耐荫，喜温暖湿润气候，颇耐寒，喜湿，耐涝干旱。碱性、中性、酸性土壤上均能生长，抗烟尘，对二氧化硫、氯、氟化氢有较强抗性;萌芽、萌蘖力较强，耐修剪，生长较快，寿命较长[2，3]。白蜡种质资源种类众多，品种的鉴定研究具有深远意义。前人研究表明由于微卫星标记技术SSR（Simple Sequence Repeat） 的不断发展和完善，为种质资源的纯度及品种真实性鉴定提供理论依据[5]。
本试验通过11对SSR引物对11个不同的品种进行遺传多样性的分析研究，拟通过DNA指纹图谱，从DNA水平鉴定新疆地区各个白蜡的品种。由于白蜡树种拥有较高的生态经济价值和发展潜力，因此综合白蜡树种资源目前的利用状况，其还有很大的研究空间。
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料为分布于新疆不同生态区域内的11个白蜡材料。
1.2 DNA提取
提取白蜡基因组DNA利用CTAB法[6]。具体操作步骤如下。
取幼嫩真叶材料1小片，用蒸馏水冲洗干净，置1.5mL的离心管中，加液氮，快速冷却;将材料快速研磨成粉末，然后加入65℃预热的CTAB提取缓冲液700μL;放入65℃水浴30～40min，每10min轻轻地振荡1次;加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）700μL，混匀5min，12000rpm离心5min;取上清液转入另一1.5mL新离心管中，加入欲冷的无水乙醇800μL，放置于4℃10min左右，让DNA充分沉淀;小心清除无水乙醇、加入欲冷70%乙醇漂洗2次;室温晾干，轻轻弹离心管，至没有水滴即可;将DNA溶于50μL或100μL的0.1倍TE中，加入RNase（10mg/mL）1μL于37℃消化15～30min;于-20℃或4℃保存。
1.3 SSR标记引物序列的获得及合成
通过引物筛选，将多态性丰富且稳定性好的SSR引物用于白蜡品种的鉴定及遗传多样性分析。具体筛选的引物组合如表1所示。
1.4 SSR反应体系
SSR标记技术反应体系如表2所示。
上述反应物混匀后于PCR仪（PTC-200TM Peltiter thermal cycler）上扩增。
程序如下：94℃5min;94℃30s;60℃45s;72℃1min;循环35次;72℃10min;10℃进行保存。
1.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物，PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。6%聚丙烯酰胺凝胶配方：6mL聚丙烯酰胺胶母液;2mL10×TBE;10mL超纯水;200μL10%过硫酸胺;20μL TEMED混合。
1.6 银染程序
1.6.1 固定
将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并轻轻取下长板，胶面朝上放入盛有2000mL固定液的塑料盒中。
1.6.2 染色
倒入2000mL染色液，染色7min后，用蒸馏水漂洗30s。
1.6.3 显色
倒入2000mL显色液，在摇床上轻摇至条带清晰地显出，显色液倒去。
1.6.4 漂洗及保存
倒入2000mL蒸馏水漂洗约30s。取出后自然晾干，扫描或照相保存。
1.6.5 溶液配置
2000mL固定液配置：1100mL蒸馏水加200mL无水乙醇加10mL乙酸）;
2000mL染色液配置：2000mL蒸馏水加3g AgNO3;
2000mL显色液：2000mL蒸馏水加30g NaOH加4mL CH2O。
1.7 谱带记录及数据分析
1.7.1 反应条带观察及统计
凝胶干燥后，形成DNA多态性图谱，对胶片上的SSR条带进行量化处理，并以0、1方式记录。将图谱上有清晰的条带记“1”，同一位置没有条带记“0”，生成“1”和“0”组成的原始矩阵。
1.7.2 数据分析
SSR转化成1、0数据后，利用NTSYS-2.10e软件中的SIMQUAL程序求Dice相似系数矩阵，用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 品种鉴定
从11对引物中筛选出4对多态性较好的SSR引物，分别对大叶白蜡（对照）、大叶白蜡伊犁1号和金叶白蜡进行鉴定区分。结果表明：引物Y112-F、Y082、Y124能够分别扩增出区分大叶白蜡（对照）和大叶白蜡伊犁1号特异条带;引物Y120、Y082能够分别扩增出区分大叶白蜡（对照）和金叶白蜡特异条带。电泳结果如图1所示。
2.2 遗传多样性分析
采用4对SSR引物对11个白蜡材料进行鉴定，聚类结果见图2。由表2可知，大叶白蜡伊犁1号和金叶白蜡与大叶白蜡（对照）遗传距离较大。
3 结语
通过建立SSR分子标记体系及指纹图谱，结果表明：引物Y112-F、Y082、Y124能够较好地区分大叶白蜡（对照）和大叶白蜡伊犁1号;引物Y120、Y082能够较好地区分大叶白蜡（对照）和金叶白蜡。SSR标记所构建的大叶白蜡指纹图谱，不受表型特征限制，也不受环境影响，可用于大叶白蜡品种的区分和鉴定。
参考文献
[1] 李庆国，刘翠兰，姚俊修，王因花，王开芳，任飞，燕丽萍，吴德军.我国中低纬度地区白蜡DNA图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].山东农业科学，2018，50（08）：19-23.
[2]陈宇，郭宇兰.大叶白蜡引种栽培试验初步研究[J].中国林副特产，2019（03）：25-26，30.
[3]燕丽萍，吴德军，毛秀红，姚俊修，任飞，李善文，王开芳，王因花，刘翠兰.基于SSR荧光标记的白蜡核心种质构建[J].中南林业科技大学学报，2019，39（07）：1-9.
（责任编辑 周康）
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