中药指纹图谱质控方法研究进展
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作者:赵娟 谢世静 赵兴华 郭明 曹长红 陈俊荣
摘要：中药的现代化、国际化是中药发展的艰巨任务和必然趋势。与现代分析技术相结合的中药指纹图谱，用能体现中药药效物质基础的化学物质群来综合评价中药质量，符合中医药理论，是国内外认可的中药质量控制的有效手段。通过详细查阅国内外学者在中药指纹图谱方面的研究工作，依据分析技术和研究内容的不同，笔者对研究频率较高的中药化学和生物指纹图谱质控方法的概念、特点、研究进展及其数据分析方法进行了概述，以期为中药指纹图谱质控方法的进一步研究提供參考。
关键词：中药化学指纹图谱;中药生物指纹图谱;质量控制;数据分析
中图分类号：R927.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）01-0082-05
1 中药指纹图谱质控方法的提出
中药大多源于自然界的生物有机体，传统中药外观性状鉴别法具有较大的主观性，而中药内在化学组成才是决定其质量与药效的根本。鉴于中药组成的多样性和辨证施治的治疗方案，检测任何一种活性成分均不能代表其整体药效，中药指纹图谱能全面、定量地反映中药所包含的化学信息，是中药质量控制的有效手段。2000年国家药监局选择研究难度相对较低的中药注射剂试推中药指纹图谱质控方法，将中药指纹图谱定义为：中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱[1]。并在样品制备、测定方法、及指纹图谱技术参数等方面提出了建立指纹图谱的一些基本原则，规范了中药指纹图谱的研究，开启了中药指纹图谱质量控制的新时代。
目前，中药指纹图谱已成为国内外公认的中药质量控制的重要方法，并被2010年版和2015年版中国药典一部收录。本研究通过查阅国内外文献，对研究工作较集中的中药化学和生物指纹图谱质控方法的概念、特点、研究进展及其数据处理进行总结。
2 中药化学指纹图谱质控方法研究进展
中药化学指纹图谱主要研究中药及其成方制剂化学成分的种类与数量，依据常用分析手段的不同可分为光谱指纹图谱法和色谱指纹图谱法。
2.1 光谱指纹图谱法
2.1.1 紫外光谱指纹图谱 紫外光谱反映的是含有不饱和键的分子吸收紫外光，价电子从低能级跃迁到高能级所产生的吸收光谱，主要反映分子中不饱和基团的性质。中药的药效成分多含有不饱和基团，具有良好的紫外吸收。当中药含有相同成分时，其紫外光谱指纹图谱也应相似，可用于中药质量评价。李和光[2]建立了寒热属性确定的51味中药的紫外光谱指纹图谱，归纳出判别寒热属性中药紫外光谱吸收峰的规律，采用多元统计法建立寒性、热性中药判别模型，探索了能代表中药寒热药性物质基础的紫外光谱指纹图谱数字化表征体系，为寒性、热性中药的下一步研究提供参考。
2.1.2 （近）红外光谱指纹图谱 （近）红外光谱是分子选择性吸收某些波长的红外线，引起分子振、转能级跃迁而产生的吸收光谱。（近）红外光谱可提供物质组成和结构特征方面的丰富信息，尤其适用于有机分子的结构分析。红外光谱尤其是近红外光谱具有无损、快速、在线、全面的分析优点，近年来被广泛应用于中药质量评价。孙国祥等[3]在全面总结现有研究的基础上，建立了中药-红外光谱指纹图谱-专家系统网格的知识库系统、试验方法推荐系统、试验方法优化系统和评价系统，并成功应用于10个产地中药材射干的判别分析。
2.1.3 荧光光谱指纹图谱 基态分子吸收能量后跃迁到激发态，激发态分子以辐射跃迁的方式将其能量释放返回基态时产生荧光，荧光光谱同样能反映中药分子中不饱和基团的性质。荧光光谱法具有检测限低、专属性好、简单快速等优点。不同中药因所含荧光物质的分子结构或含量的差异，其荧光光谱具有指纹特征，可用于中药质量评价。史训立[4]扫描了200多种常见标准药材的三维荧光光谱指纹图谱，构建了中药三维荧光指纹图谱数据库，成功应用于中药材的质量评价。
2.2 色谱指纹图谱法
2.2.1 薄层色谱指纹图谱法 薄层色谱系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，利用各组分对同一吸附剂吸附能力不同，通过连续的吸附、解吸附过程达到分离目的，以比移值为分析指标。薄层色谱具有成本低，对样品预处理要求低、快速、高效等优点，非常适合药物的基层日常分析与现场检验。1990年版中国药典引入了对照药材的薄层色谱鉴别，获得的薄层图谱增加了测定结果分析的客观性，具有早期的指纹图谱鉴别意味。谢培山课题组完成了三种人参类药材[5]、黄连[6]、高良姜[7]中黄酮类成分，柴胡属药材皂苷类成分[8]的薄层色谱指纹图谱研究，可很好地控制中药材的质量。目前，薄层色谱技术仍是中国药典里中药材鉴别的有力工具，并应用于辅助建立多种中药及其制剂的质量标准研究[9]。
2.2.2 气相色谱指纹图谱法 气相色谱是采用气体作为流动相的色谱法。利用待分离组分在气相和固定相间的分配差异达到分离目的，以保留时间为定性指标，峰高或峰面积为定量指标。气相色谱法主要适用于含挥发性成分较多且对热稳定的中药和其成方制剂的质控研究。戴静波等[10]采用气相色谱-质谱联用技术分别建立了10批荆芥油的指纹图谱，采用聚类分析法进行相似度比较，结果表明气相色谱指纹图谱特征明显，方法准确可靠，可用于中药质量控制。
2.2.3 高效液相色谱指纹图谱法 高效液相色谱是20世纪六十年代后期借鉴气相色谱理论，在经典液相色谱法的构造中引入高压输液系统，采用小颗粒填充材料发展起来的，同样以保留时间和峰高/峰面积作为定性和定量依据。高效液相色谱可与多种检测器联用，例如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器、二极管阵列检测器等，分析范围广，适用于中药复杂组分的分析。此外，由于高效液相色谱检测器保留了被分离物质的完整性，可作为前期分离、提纯的手段，进一步与质谱仪串联，为中药质量分析提供更加准确、可靠的信息。分离效能高、分析范围广、分析仪器自动化、灵敏度高、重现性好等优点，使高效液相色谱成为构建中药指纹图谱的首选方法。孙露露等[11]建立了12批泰山虫草药材高效液相色谱指纹图谱，并比较不同批次抗肿瘤生理活性差异，发现了各共有指纹峰与药效的关联度，并确定核苷类成分是泰山虫草发挥抗肿瘤活性的主要成分，可用于泰山虫草品质的综合研究。 2.2.4 超高效液相色谱指纹图谱 超高效液相色谱是借助于高效液相色谱的理论及原理，进一步缩小了固定相填料粒度且提高了输液压力，是近年来发展起来的新技术，具有高分析通量、高灵敏度、高自动化等特点，尤其适合于中药复杂组分的研究。2010年版中国药典已经收载了复方丹参滴丸超高效液相色谱指纹图谱鉴别法。范旭航等[12]构建了快速分析牡丹皮药材的超高效液相色谱特征指纹图谱共有模式，15批次药材的指纹谱图重合度较好，表明批次间牡丹皮药材质量较为稳定，可用于快速评价牡丹皮药材质量。
2.2.5 毛细管电泳指纹图谱法 毛细管电泳法是在高压直流电场驱动下，根据待分离组分淌度和分配行为上的差异，在毛细管分离通道上实现分离的电泳分离技术。具有分析速度快、分析成本低等优点，适用于中药中无机离子到带电生物大分子的分析研究。许丽莹等[13]应用区带毛细管电泳法建立了冠心宁注射液对照指纹图谱，在最佳电泳条件下，应用毛细管电泳一测多评技术在35min内实现了8批冠心宁注射液中7种主要有效成分的含量测定，此方法可用于全面评价冠心宁注射液的质量，可为其他中药注射剂的质量评价提供参考。
3 中药生物指纹图谱质控方法研究进展
中药化学指纹图谱能提供中药化学组成方面的丰富信息，但存在指纹图谱与药效信息脱节问题，中药生物指纹图谱有望解决这一难题。中药生物指纹图谱致力于中药生物遗传特性和药理学研究，旨在阐明中药的药效作用机制及毒理作用机制，主要包括中药基因组学、中药蛋白质组学和中药代谢组学。
3.1 中药基因组学 陈士林研究员提出的“本草基因组学”是中药基因组学的前沿研究，它从基因组水平探索中药和其药理作用，采用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络，寻找中药防治人类疾病的分子机制。陈士林课题组首创基于ITS2的中草药DNA条形码鉴定技术：在全部正品药材样品中寻找相同的一段DNA片段进行测序，建立该药材的对照品数据库，可用于未知样品或掺杂品的鉴别，具有基因指纹图谱鉴别意义[14]。该DNA条形码鉴定技术已被2010年版和2015年版中国药典DNA条形码分子鉴定法指导原则收录，并编写专著《中国药典中药材DNA条形码标准序列》，力求从基因水平上破解中草药品种真伪鉴别的难题[14～15]。
3.2 中药蛋白质组学 中药蛋白质组学是在分子水平上研究中药药效物质基础和药理作用的相关性，可用于中药质量控制及中药新药研究。主要包括两个方面的研究：一是通过中药干预前后蛋白质表达差异谱的研究，寻找中药的可能靶点相关蛋白质，另一方面是通过不同中草药及其不同组分蛋白质表达差异的研究，寻找中药药用功能的机制。曹彬[16]构建了慢性心力衰竭的大鼠模型，造模成功后随机分成4组给予不同治疗，研究不同治疗方案下各组织的病理改变，利用蛋白组学技术筛选药物干预前后慢性心衰大鼠肝脏组织的表达差异蛋白。实验结果表明四君子汤能明显延缓不良条件下肝脏组织的病理变化，提高肝脏线粒体相关蛋白质的合成，验证并深化了中医理论，为进一步研究提供了方向。
3.3 中药代谢组学 代谢组学研究的是生物体系受到内在和/或外在因素刺激后引发的内源性代谢物质改变的学科，是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的系统生物学的重要研究领域。中药代谢组学指纹图谱研究不仅可以反映中药材化学组成方面的差异，更重要的是可以通过对内源性代谢物的分析，客观反映药效学或生物效应的差异。秦雪梅课题组在中药的代谢组学技术质量评价方面进行了很多前瞻性的研究[17]：分析基原对柴胡、黄芪药材质量的影响，不同产地、采收期款冬花药材质量的差异比较，远志药材良种定向选育，炮制手段对柴胡、白芍、醋细辛质量的影响，研究结果证实代谢组学技术可作为现有药材质量评价手段的有力补充。
4 中药指纹图谱数据分析方法研究进展
中药指纹图谱数据量大，人工辨别耗时且不客观。为实现复杂指纹图谱数据的科学解析，专家们提出了多种中药指纹图谱数据处理方法。
4.1 化学模式识别 化学计量学借助多学科的理论和方法优化化学量测过程，通过分析实验获得的包含大量信息的数据，最大限度的提取有效化学信息[18]。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分，在中药指纹图谱数据分析中应用较多的化学模式识别方法包括聚类分析法、主成分分析法和偏最小二乘法。
4.1.1 聚类分析法 利用统计学方法根据未知样本的变量特征，以相似度进行归类，主要的聚类指标是相关系数和距离[18]。由于中药本身所具有的规范性较差的特点，其质量易受道地性、季节气候、采收期、加工方式等多种因素的影响，聚类分析法较早应用于中医药研究。冀艳花等[19]建立了15批次白鲜皮药材的高效液相色谱指纹图谱，采用聚类分析法可将指纹图谱分为3类，明确了不同种类间差异较大的化学成分，可用于白鲜皮药材质量评价。
4.1.2 主成分分析法 利用方差最大原则和降维的思想，将多个变量转化为少数几个互不相关的综合变量，即主成分，每个主成分都能够反映原始变量的大部分信息，且所含信息互不重叠[18]。主成分分析法将复杂因素归结为几个主成分，可以实现数据降维，简化问题，在中医药研究中广泛应用。靳怡然等[20]建立了不同产地18批冬凌草药材的高效液相色谱指纹图谱，采用主成分分析法和相似度分析法进行指纹图谱数据分析，两种分析方法结果准确一致，可用于冬凌草药材质量评价。
4.1.3 偏最小二乘法 以中药指纹图谱检测为例，偏最小二乘法分解数据时不仅考虑中药提取物含量矩阵和响应矩阵，而且在分解含量矩阵的同时考虑响应矩阵以及在分解响应矩阵的同时考虑含量矩阵，从而克服了非线性因素的影响，尤其適用于小样本多变量的中药指纹图数据分析。偏最小二乘法被称为第二代回归方法，与传统相似度计算方法相比，偏最小二乘法得到的结果更加准确，计算速度更快。张昱[21]通过实验条件和方法学优化，建立了牛黄上清片高效液相色谱图谱，结合偏最小二乘法判别分析和相似度评价，实现了不同厂家、不同批号牛黄上清片样品的质量研究。同时利用正交偏最小二乘法研究牛黄上清片指纹图谱归一化峰面积与其相对体外抗内毒素活性的谱效关系，确定了可能的抗内毒素活性物质。 4.2 中药色谱指纹图谱相似度评价软件 色谱技术是目前建立中药指纹图谱的首选方法，为实现对获得中药色谱指纹图谱数据的快速匹配和识别，专家们分别开发了多种相似度评价软件[22]。为统一中药色谱指纹图谱相似度评价指标，2004年3月由国家药典委员会牵头，联合指纹图谱主要科研单位组成开发小组，综合各版本软件优势，开发了《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》研究版（2004A）和检验版（2004B）。其中，2004A版本具有生成对照谱图的功能多应用于科学研究，2004B版本没有生成对照谱图的功能多应用于检验工作。此相似度评价系统的推广促进了指纹图谱标准化研究的进程。
4.3 中药指纹图谱数据库 中药指纹图谱的研究工作需要长期大量资料和经验的积累，为更好的实现对已有研究资料的存储和共享，专家们采用多种分析技术对中药指纹图谱数据库进行了研究。何淑华等[23]构建了由150余幅对照中药材红外光谱图组成的红外光谱数据库，可用于中药材真伪的快速鉴别。黄新宇[24]使用计算机算法研发了紫外光谱数据库-UVDB2，利用常见化合物的真实紫外吸收数据构建了紫外光谱数据库-UV1，实现了在UVDB2中寻找计算光谱，在UV1中匹配、预测化合物不饱和结构信息等功能。刘训红等[25]归纳整理了已发表药学期刊或相关专著中3000余幅多种研究方法获得的中药指纹图谱，建立了数据广泛、检索方便、维护与更新简单的中药指纹图谱数据库，更利于数据资源共享和日常中药质量评价。孙国祥等[26]采用多种开发环境和工具，构建了中药指纹图谱在线专家系统数据库，涵盖了中药材及其制剂常见分析技术指纹图谱及其他与中药药效、实验条件、管理等等相关的大量信息，具有强大的查询功能，是目前比较先进的国内中药指纹图谱数据库。
5 展望
中药质量的安全、稳定、可控是中药可持续发展和国际化的关键。經过广大学者近20年的研究，中药指纹图谱质控方法从研究思路、分析技术、数据处理等方面都取得了非常大的进展。以后的研究中，应更加注重中药指纹图谱化学信息与生物活性的结合，加强中药实际药效成分指纹图谱的生物等效性研究，以便更好地控制中药质量，阐明中药药理机制。
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（收稿日期：2019-10-28）
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