海南橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素蛋白基因检测与致病性分析

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　　收稿日期： 20190306   修订日期： 20190423
　　基金项目：海南大学高层次人才引进科研启动基金（KYQD（ZR）1732）;海南省自然科学基金（319MS015）
　　致  谢： 感谢海南大学林春花老师对本试验技术上的指导！
　　通信作者 E-mail：刘铜liutongamy@sina.com; 左豫虎zuoyhu@163.com
　　# 为并列第一作者
　　摘要 Cassiicolin毒素蛋白是橡胶树棒孢霉落叶病菌的主要致病因子。本研究对分离自海南省5个市县的橡胶树棒孢霉落叶病菌进行了鉴定，形态学鉴定结合分子生物学鉴定结果表明，病原菌为多主棒孢。利用Cassiicolin毒素不同亚型编码基因特异性引物和菌饼活体接种法分别鉴定了分离菌株的毒素蛋白类型和致病性，结果显示，分离的35个菌株都含有Cas5基因，未发现含其他类型的毒素基因，表明海南橡胶树棒孢霉落叶病菌为含Cas5毒素蛋白优势群体;所有菌株对橡胶树品种‘RRIM600’都能够致病，但是在不同抗性品种上致病性存在一定差异。
　　关键词 橡胶棒孢霉落叶病; 多主棒孢; 毒素; 致病性
　　中图分类号： S 435.76
　　 文献标识码： A
　　 DOI： 10.16688/j.zwbh.2019110
　　Isolation， identification of the cassiicolin and pathogenicity analysis of Corynespora leaf fall disease of Hevea brasiliensis in Hainan
　　QU Jiannan1， CHEN Di2， HOU Jumei2， LIU Zhen2， CUI Jia1， LIU Tong2， ZUO Yuhu1
　　（1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China;
　　2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）
　　Abstract
　　Cassiicolin is the main pathogenic factor of Corynespora cassiicola. In this study， pathogens were isolated from Hevea brasiliensis samples infected with Corynespora leaf fall disease collected from five cities and counties of Hainan province， and were identified as C.cassiicola by morphological and molecular methods. The cassiicolin subtypes and pathogenicity of isolates were analyzed by using specific primers of cassiicolin and inoculation with fungus cake in vivo. The results showed that 35 isolates of C.cassiicola contained Cas5 protein， and no other types of proteins were found. It indicated that Cas5 was the dominant population in Hainan. All isolates of C.cassiicola were found to be pathogenic in ‘RRIM600’ rubber species， but they also showed different pathogenicity in different rubber varieties with resistance to C.cassiicola.
　　Key words
　　Corynespora leaf fall disease; Corynespora cassiicola; cassiicolin; pathogenic
　　橡膠树Hevea brasiliensis属于大戟科三叶橡胶属，其产物天然橡胶作为重要的工业原料，广泛运用于农业、工业、国防、交通、日常生活和医药卫生领域等方面[1]。由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的橡胶棒孢霉落叶病是橡胶树Hevea brasiliensis上一种重要的叶部病害，给我国橡胶生产带来严重的危害[2]。2010年，Shimomoto等利用延伸因子（EF-1α）、微管蛋白（β-tubulin）和钙调蛋白（Calmodulin）序列对不同地区和不同作物中分离得到的多主棒孢进行了同源性分析[3]。Barthe等研究表明，橡胶树多主棒孢产生的cassiicolin毒素蛋白是该病菌的主要致病因子，并且在不同的菌株中存在不同毒素蛋白亚型[4]。Déon等根据多主棒孢中Cas基因的差异，将病原菌分为6个毒素亚型[5]。2016年刘先宝等报道中国橡胶树多主棒孢优势群体为Cas5亚型，在海南发现存在一株含有Cas2亚型的菌株，推测是来源于其他作物[6]。Shuib等鉴定发现马来西亚橡胶树多主棒孢主要为Cas0与Cas5亚型[7]。Déon等从巴西巴伊亚无病症橡胶树叶片中分离到的多主棒孢中检测到了Cas3和Cas4亚型[8]。Tran等研究发现Cas1亚型毒素比Cas5亚型毒素对橡胶树叶片致病性更强[9]。近年来，海南橡胶树棒孢霉落叶病在苗圃和幼龄树上的危害有加重趋势[10]，是否有新的毒素蛋白亚型出现和致病性分化尚未见报道。本研究拟从海南各主要植胶产区采集、分离橡胶树棒孢霉落叶病菌菌株，通过毒素蛋白基因检测和致病性分析，以期明确海南橡胶树棒孢霉落叶病菌群体毒素类型和致病性变化情况，为科学防治海南橡胶树棒孢落叶病提供基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　于2017年5、7月和11月，参照《橡胶树主要病害诊断与防治原色图谱》[11]中橡胶树棒孢霉落叶病病斑形态特征，分别在海南省儋州市、白沙黎族自治县、五指山市、乐东黎族自治县和保亭黎族苗族自治县橡胶林采集橡胶树棒孢霉落叶病的病叶。
　　健康橡胶苗‘文昌11’‘热研7-33-97’‘热研7-20-95’‘热研8-79’‘RRIM600’，由国家橡胶树种质资源圃提供。
　　葡萄糖、琼脂糖、无水乙醇为生工生物工程（上海）股份有限公司提供。50×TAE、PGM-T Ligation Kit为天根生化科技（北京）有限公司产品。
　　1.2 方法
　　1.2.1 病原菌的分离与纯化
　　在海南大学海甸校区热带农林学院植物病害防控实验室采用组织分离法进行病原菌分离。选取叶片新鲜、病斑清晰的橡胶树叶片，利用手术剪在无菌操作台中剪取病健交界处约0.5 cm×0.5 cm病叶组织，用75%乙醇浸泡3～5 s，然后用无菌水清洗3～5次，转接于PDA培养基平板上，28℃培养3～4 d，待长出菌丝后挑取到新的PDA平板上，转接3～4次。将纯化得到的病原菌进行单孢分离，转接到PDA试管斜面，4℃保存备用。
　　1.2.2 致病性分析
　　将‘文昌11’‘热研7-33-97’‘热研7-20-95’‘热研8-79’‘RRIM600’移栽至海南大学海甸校区实验基地。每个品种各50株，株高约1 m，每株8～10个分枝，21～30片叶，待移栽橡胶树苗生长出3～5个新分枝，选取中部健康叶片，进行室外活体接种。在每个叶片叶脉左侧中间处用无菌牙签轻微刺伤并接一个菌饼，空白对照为刺伤后接种PDA培养基，每个品种接种9个叶片，套袋保湿培养。接种9 d后，记录发病情况，试验重复3次。根据柯赫氏法则，待叶片发病后与自然发病叶片症状进行比较，并重新分离病原菌，与原接种菌进行比较。
　　1.2.3 病原菌形态学鉴定
　　将分离纯化的病原菌接种于PDA平板上，28℃培养，观察7 d菌龄的菌落形态特征、颜色，并记录其生长速度。利用涂布器将在PDA平板上生长10 d的病原菌菌丝刮去，并利用三层灭菌纱布包裹培养皿口，在人工气候箱中，28℃光照培养3 d，然后加入适量无菌水并利用涂布器轻刮平板，利用三层纱布过滤，得到病原菌孢子悬浮液用于分生孢子形态观察。病原菌分生孢子形态参照《真菌鉴定手册》[12]进行比对鉴定。
　　1.2.4 病原菌分子生物学鉴定
　　为了更精确地鉴定病原菌，通过CTAB法[14]提取DNA，利用通用引物ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白基因（β-tubulin）[34]（表1）进行PCR，回收PCR产物，将产物连接到PGM-T载体，送至广州天一辉远公司进行测序，将测序结果在NCBI进行比对分析。
　　将获得的ITS序列、延伸因子（EF-1α）序列和微管蛋白（β-tubulin）序列分别与GenBank数据库（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中18株棒孢属菌株BS2、ST3、T1、FN3、GEV1559、NRC2-1、EH-1070、HLH-1-1、ZM160181、KMC1、CCC85、XQ3-1、FCC90、ACC42、PCC86、CGJ1、CBS 135133、CPC 31708和长喙壳菌MUCL44885、尖孢镰刀菌R1、疫霉Ps-737、灰葡萄孢F734的ITS序列、延伸因子（EF-1α）序列和微管蛋白（β-tubulin）序列进行比较，利用MEGA 7进行聚类分析，构建系统发育树。
　　1.2.5 毒素蛋白亚型鉴定
　　利用6种毒素亚型Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5和Cas6特异性引物[5，8]（表1）对病原菌毒素亚型鉴定，回收PCR产物，将产物连接到PGM-T载体，送至广州天一辉远公司进行测序，将测序结果在NCBI进行比对分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 病原菌分离与纯化
　　从儋州市、白沙黎族自治县、五指山市、保亭黎族苗族自治县、乐东黎族自治县橡胶林采集的病叶中分别获得19、6、2、1和7株病原菌，共35株病原菌。根据其采集的地点及叶片的采集顺序进行编号，对纯化后的病原菌进行形态观察。
　　2.2 致病性分析
　　通过致病性鉴定，35株分离菌株均能侵染‘RRIM600’橡胶树。有7、9、21、28株分离菌株分别能够侵染‘文昌11’‘热研7-33-97’‘热研8-79’‘热研7-20-95’叶片并导致发病（表2），有6株病原菌DZ-27、DZ-123、DZ-131、BS-35、BS-37、BS-43对供试的5个橡胶树品种均具有侵染性，它们分别分离自儋州市与白沙黎族自治县的橡胶树病叶。这些结果表明海南省橡胶树棒孢落叶病菌在不同抗性橡胶树品种上的致病性不同，所有分离菌株对‘RRIM600’都具有致病性。
　　室外接菌试验表明，品种‘RRIM600’叶片发病率达100%，但不同菌株引起的发病程度有差异，空白对照未发病。发病橡胶树叶片病斑呈鱼骨状，与自然条件下橡胶树棒孢霉落叶病病斑相同。在接菌保湿培养的第9天，采集发病的橡胶树叶片，对其病菌进行再分离，35株病原菌均与供试菌株菌落形态相同，病菌回收率为100%，确定其为橡胶树棒孢霉落叶病的致病菌。
　　2.3 病原菌形态学鉴定
　　参照《橡胶树主要病害诊断与防治原色图谱》[12]中菌落生长及形态特征，对病原菌进行初筛，发现35株病原菌均疑似为多主棒孢。利用PDA培养基对35株病原菌进行培养，发现所有菌株第3天均产生大量气生菌丝，菌丝丛生，呈绒毛状;随着培养天数的增加，基生菌丝逐渐变成褐色或黑色，气生菌丝呈灰色或白色绒毛状，菌落边缘呈灰色或白色菌圈，部分菌落产生红褐色色素（表3）。对35株病原菌进行孢子形态观察，发现35株病原菌孢子均为顶生，单生，呈倒棍棒状，直立或略弯曲，大小為（30～60）μm×（3～10）μm，有3～16个隔（图1）。与《真菌鉴定手册》[13]描述的橡胶树多主棒孢菌的形态相似，可初步鉴定为多主棒孢。 　　2.4 病原菌分子鉴定
　　分别利用ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白（β-tubulin）通用引物对35株病原菌进行PCR检测，均得到单一条带。将测序结果通过NCBI比对，发现所有菌株与所报道的多主棒孢具有99%以上同源性。进一步将35株病原菌与18株已鉴定的棒孢属菌株、蛇口目杆菌Ophiostoma bacillisporum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、疫霉菌Phytophthora niederhauserii和灰葡萄孢Botrytis cinerea的rDNA-ITS，EF-1α，β-tubulin进行遗传进化分析，35株菌株与已知的棒孢属多主棒孢聚集
　　在一起，表明分离获得的35株病原菌为多主棒孢C.cassiicola（图2）。
　　2.5 毒素蛋白亚型的检测
　　利用特异性毒素亚型鉴定引物Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6对35株病原菌进行检测，仅有Cas5引物能扩增出一条电泳条带。通过测序和NCBI对比，结果显示35株病原菌均携带Cas5基因，即35株多主棒孢均属于Cas5亚型（图3），表明海南橡胶树棒孢霉落叶病菌为含Cas5毒素蛋白优势群体。
　　3 讨论
　　Déon在2014年利用ITS对来自不同作物的128株多主棒孢进行了同源性分析，研究结果显示128株多主棒孢可分为7个分支，其中含相同毒素基因的多主棒孢分别聚类到同一分支，表明含不同毒素亚型的菌株存在遗传上的分化[6]。本研究同时利用ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白（β-tubulin）对橡胶树上分离得到的病原菌进行遗传进化关系分析，35株病原菌都聚集在同一分支，尚未发现海南省橡胶树棒孢霉落叶病病原菌存在遗传分化。
　　刘先宝等在6个省的5个物种中进行多主棒孢的分离鉴定与毒素蛋白亚型检测，在海南省橡胶树中分离得到14株多主棒孢，其中13株中检测到Cas5毒素蛋白，1株中检测到Cas2毒素蛋白，推测含Cas2基因的菌株可能来自于其他作物，并非来自橡胶树[7]。本研究于2017年5、7月和11月，在海南省橡胶主产区橡胶树中分离得到35株多主棒孢，橡胶树棒孢霉落叶病菌素毒蛋白亚型检测结果表明所有供试菌株只含有Cas5，均未检测出其他毒素蛋白。因此可以明确海南橡胶树棒孢落叶病菌的毒素蛋白为Cas5亚型。
　　通过对35株多主棒孢进行致病性检测，得到6株强致病性菌株，分别来自海南省北部的儋州市与白沙黎族自治县，而在海南省中部及南部的保亭黎族苗族自治县、五指山市和乐东黎族自治县分离得到的多主棒孢致病性较弱，推测海南省多主棒孢的致病性可能与地理位置有关。35株多主棒孢对不同橡胶树品种的致病性有较大差异，采用抗病品种可以有效防治该病。另外，对所有供试分离菌株在同一橡胶树品种做致病性检测时，发现其致病性也存在明显的差异。因此推测该病原菌除了Cas5毒素蛋白为重要致病因子外，可能还存在其他的致病因子。
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　　（責任编辑：田 喆）
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