海南花生果腐病菌的分离、鉴定及生物学特性研究

来源:用户上传      作者:刘小玉 付登强 余凤玉

　　摘要：近几年，花生果腐病是花生上发生较为严重的一种病害，为明确海南花生果腐病病原菌的生物学特性，有效开展病害防治工作，降低该病危害，采用病原菌分离、鉴定，并对其生物学特性进行研究。通过对其培养特性、形态特征的观察及rDNA的转录间隔区（internal transcribed spacers，简称ITS）序列测定，与GenBank中同源性较高的菌株进行序列对比，最后将菌株JGF2确定为镰刀菌。生物学特性研究表明，JGF2菌丝在PDA培养基上生长最快，菌丝生长的最适宜温度为20～35 ℃，最适pH值为8，乳糖为最佳碳源，牛肉浸膏为最佳氮源。
　　 关键词：海南省;花生;果腐病;鉴定;生物学特性;转录间隔区
　　 中图分类号：S435.652   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0104-03
　　 花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，具有很高的营养价值和经济价值，在国民经济中占有重要地位，而近年来我国各大花生产区不断受到植物病害的侵染，严重影响花生产量和品质[1-3]。花生果腐病，别称烂果病，主要表现在花生荚果腐烂，轻者半个荚果为褐色或黑色，里面的籽粒小而硬实，发育不良，严重者整个荚果都为深黑色，果皮和籽粒均已腐烂。花生果腐病在我国各大花生产区发生，轻则减产20%，严重的减产80%以上，尤其是在重茬地块，有逐年加重趋势[4-5]。国内外研究报道，花生果腐病的病原菌种类复杂，不同地域有不同的致病病原菌，目前我国山东[6]、河北[7]等地有花生果腐病病菌分离鉴定的相关报道，但海南花生还未见相关报道。鉴于果腐病对花生产业的潜在威胁，本研究通过组织分离法对海南文昌花生果腐病的病原菌进行分离、鉴定，并对形态学及生物学特性进行研究，旨在明确病原菌种类，探明其发生传播规律，为该病害的防治提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与培养基
　　1.1.1 试验材料 从海南文昌花生地采集5株地下荚果有黑色不规则病斑、地上部叶片脱落的花生样品。
　　1.1.2 培养基 培养基配制方法参考余凤玉等报道[8]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 病原菌的分离 采用常规组织分离法分离病原菌[9]。
　　1.2.2 致病性测定 按照柯赫氏法则进行致病性测定。
　　1.2.3 病原菌形态学观察 将纯化后的病原菌接种到PDA培养基平板上，在25 ℃恒温培养箱中黑暗培养，观察记录菌落形态学特征。
　　1.2.4 DNA提取、PCR扩增及序列测定 将分离菌株在PDA培养基上培养5～7 d后，收集新鲜的湿菌体0.1～0.3 g，用液氮在研钵中磨碎，装入 1.5 mL 的离心管中，然后用基因组DNA快速提取试剂盒（真菌）提取DNA。利用通用引物ITS1和ITS4对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增。并将PCR产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，采用BioEdit、Mega 5.0等软件对菌株进行系统发育分析，构建系统发育树。
　　1.2.5 培养基对菌丝生长的影响 将活化的供试菌株用打孔器打成直径为6 mm的菌饼，接种于直径为9 cm的6种供试培养基平板中央，25 ℃恒温培养，每个处理重复5次，2 d后用十字交叉法测量菌落直径。
　　1.2.6 pH值对菌丝生长的影响 用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液将PDA培养基pH值调节到4、5、6、7、8、9、10、11共8个酸碱度。其他同“1.2.5”节。
　　1.2.7 碳源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基础培养基，其中蔗糖分别用等质量碳素的甘露醇、D-果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、阿拉伯树胶粉、甘油等7种碳源替代，设置无碳作为对照，配制成不同的碳源培养基。其他同“1.2.5”节。
　　1.2.8 氮源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基礎培养基，其中硝酸钠分别用等质量氮素的蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏、磷酸二氢铵等5种氮源替代。设置无氮作为对照，配置成不同的氮源培养基。其他同“1.2.5”节。
　　2 结果与分析
　　2.1 病原菌分离纯化及致病性
　　 从发病花生果壳样品中，分离到5个分离物，用孢子悬浮液接种到花生荚果上，5株均产生与田间相似症状，其中JGF2致病性最强。从接种发病的花生病健交界处分离纯化病菌，经比较与原接种菌株在形态上相同，确认所分离到的分离物为发病植株的病原菌。
　　 菌株JGF2 25 ℃在PDA培养基上菌丝为白色，绒毛状，显微镜观察到2种不同分生孢子，大型分生孢子镰刀型，稍弯曲，3～5个隔膜;小型分生孢子长椭圆形至卵圆形，无隔或1个分隔。依据Leslie等的方法[10]鉴定该病原菌均为镰刀菌。
　　2.2 病原菌基因序列分析
　　 经rDNA ITS1和ITS4引物对菌株JGF2进行PCR扩增，获得1条长度为595 bp的片段。将该序列与GenBank中核酸数据库（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行同源性比较，基于ITS序列构建系统发育树。如图1所示，菌株JGF2与镰刀菌同源性高达100%，进化分析聚在同一分支上，因此可以确定菌株JGF2为镰刀菌。
　　2.3 培养基对菌丝生长的影响
　　 菌株JGF2在6种不同的培养基上均能生长，但在PDA培养基上菌丝生长最快，菌落直径最大，2 d后均长满平板，且菌落致密浓厚;其次为Richard培养基，菌落直径为（8.0±0.8） cm;在琼脂培养基上生长较差，菌落直径最小，仅有（4.5±0.3） cm，菌丝也最稀疏。由图2可知，菌株JGF2在不同培养基上菌丝生长差异明显，PDA培养基最有利于菌丝的生长。 　　2.4 pH值对菌丝生长的影响
　　 由表1可知，菌株JGF2在pH值为4～11条件下菌丝均能生长，其中pH值为8时，菌丝生长最快，长满平板，而且菌丝生长茂盛、紧密;而在pH值为9～11条件下，菌丝生长差异不显著。
　　2.5 碳源对菌丝生长的影响
　　2.6 氮源对菌丝生长的影响
　　 由表3可知，不同氮源对菌株JGF2菌丝生长的影响显著，最适宜的氮源是牛肉浸膏，长满平板;其次是硝酸钠，菌落直径为8.1 cm;硫酸铵作为氮源菌落直径最小，为2.7 cm，不适合该病原菌的生长;对照的菌落直径为7.1 cm，但菌丝相当稀薄，在生长范围内，培养基并未完全被菌丝覆盖，而其他氮素培养基上，在生长范围内培养基被菌丝完全覆盖，菌丝浓密。
　　3 讨论与结论
　　 随着人民生活水平的提高，嫩花生作为鲜食食品越来越受大家的青睐，发展前景十分广阔。然而，近年来我国各大花生产区不断受到植物病害的影响， 特别是花生果腐病发病频繁。花生果腐病别称烂果病，在多年重茬种植的地块结荚期遇雨水较多时发病加重。由于常年高温多湿的气候影响，海南花生果腐病已成为花生的一种主要病害，对产量和品质的影响极其严重。本研究通过对花生果腐病病菌的鉴定，尤其是对其进行系统的生物学特性研究，为该病害田间防治奠定理论基础。
　　 根据病原菌的形态学特征分析结果，花生果腐病病原菌鉴定为镰刀菌。镰刀菌尤其是茄病镰刀菌在自然界中普遍存在，是多种植物及动物的致病菌[11-12]，能引起植物根腐、枯萎等症状，其产生的毒素不仅影响植物生长，也影响植物品质[13]。本研究结果表明，从海南省文昌市采集到的花生果腐病主要是由鐮刀菌引起的，其镰刀菌ITS序列长度为 595 bp，是否还有其他病菌与之混合侵染，需进一步采样分离鉴定。另外，本试验生物学特性研究表明，菌株JGF2菌丝在PDA培养基上生长最快，菌丝生长的最适宜温度为20～35 ℃，最适pH值为8，乳糖为最佳碳源，牛肉浸膏为最佳氮源。
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