美洲南瓜枯萎病菌分离鉴定及其生物学特性

来源:用户上传      作者:李金峰 刘佳 侯敏 张树武 沈志彦 徐秉良 陈荣贤

　　摘 要： 通过采用病原菌形态学观察、ITS分子鉴定、病原菌生物学特性测定，明确甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病的病原菌及其生物学特性。结果表明，引起甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病的病原为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）。该病原菌在25 ℃、12 h光暗交替，pH为8，以淀粉为碳源时生长最好。以硝酸钠和尿素为氮源时其生长速率最快，以牛肉浸膏为氮源时最有利于产孢。美洲南瓜枯萎病的病原菌及生物学特性的明确，为后续的病害防治等方面提供了理论基础。
　　關键词： 美洲南瓜;枯萎病;分离鉴定;尖孢镰孢菌;生物学特性
　　Abstact： In this study， morphological observation of pathogens， molecular identification of ITS， and determination of biological characteristics of pathogens were used to determine the pathogens and biological characteristics of Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province. The results showed that the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province was Fusarium oxysporum. The fungi was alternated in light and dark at 25 ℃， 12 h， pH 8 and grew best when starch was used as the carbon source. When sodium nitrate and urea were used as nitrogen sources， the growth rate was fastest， and when beef extract was used as nitrogen source， it was most conducive to spore production. The pathogens and biological characteristics of the Cucurbita pepo Fusarium wilt disease provide a theoretical basis for subsequent disease control.
　　美洲南瓜（Cucurbita pepo）属于葫芦科南瓜属（Cucurbita），别名为西葫芦、番瓜等，原产于北美洲南部地区。因其含有多种营养成分，具有很高的食用和药用价值，在我国大部分地区普遍栽培[1]。甘肃省武威市是美洲南瓜的重要育种研发和生产基地，也是当地重要的经济作物之一[2]。
　　瓜类枯萎病是瓜类生产上最难防治的土传性病害之一[3]，其中，以西瓜发病最重，南瓜次之，一般可导致减产20%～30%，严重时可达50%～60%，其中连作地的发病情况最为严重，常可导致全田无收，加之近年来枯萎病对美洲南瓜的危害日益严重，但其防治较为困难。因此，枯萎病的危害是瓜类生产上急需解决的重要问题[4]，也成为限制美洲南瓜生产的重要因素之一[5]。
　　研究表明，瓜类枯萎病的病原菌多为尖孢镰孢菌[6]。引起甜瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰孢菌甜瓜专化型Fusarium oxysporum f. sp. melonls[7]。徐彦刚等[8]研究表明，尖孢镰孢菌黄瓜专化型F. oxysporum f. sp. cucumerinum是造成黄瓜枯萎病的病原菌。吕佩珂等[9]研究认为，尖镰孢菌西瓜专化型 F. oxysporum f. sp. niveum为侵害西瓜的枯萎病病原菌。但是，关于近几年来甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病病原菌的相关报道相对较少。
　　明确病原菌的种类及其生物学特性是进行病害防治的基础工作，因此，笔者对甘肃省武威地区的美洲南瓜枯萎病病原菌进行分离鉴定，并对其生物学特性进行研究，以期为美洲南瓜枯萎病的防治奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　供试的美洲南瓜品种‘金苹果12号’‘金苹果9号’‘三星’‘四星’‘P3’和‘P13’均由甘肃省武威市金苹果有限责任公司提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 病样采集 2018年6月15日，在甘肃省武威市金苹果有限责任公司种质资源试验基地随机采集美洲南瓜‘金苹果12号’‘金苹果9号’‘三星’和‘四星’品种的枯萎病发病植株共20株。将病样带回甘肃农业大学植物保护学院植物病毒与分子学研究实验室进行分离鉴定。
　　1.2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌分离与纯化 供试培养基： PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，琼脂粉（进口）10 g，用水定容至1 000 mL，用于病原菌的分离纯化培养。
　　CLA培养基：新鲜康乃馨叶片小块灭菌后放入培养皿中，每皿5～10片，琼脂粉（进口）10 g，加水定容至1 000 mL，用于病原菌大小型分生孢子的观察培养。
　　Czapek培养基：1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、30 g蔗糖、0.5 g KCl、2 g NaNO3、琼脂粉（进口）10 g、用水定容至1 000 mL，用于不同碳氮源对美洲南瓜枯萎病菌的培养。
　　组织分离法：用无菌水将病株样品茎基部和根部冲洗干净，用无菌滤纸将水分吸干，在超净工作台中将发病茎基部和根部的病健交界处切成5 mm×5 mm的小块，将处理好的小块用75%乙醇浸润10 s，再用0.1%升汞溶液消毒2～3 min，然后用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干残余水分。将此病健交界小块采用五点法接于PDA平板上，然后将其放入恒温培养箱中培养约3～4 d，温度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，及时挑取根段周围长出的菌落接种于新的PDA平板上，置于25 ℃培养箱中恒温培养[10]。 　　待纯化的菌落生长5～10 d，用无菌水冲洗菌丝表面，收集孢子或菌丝悬浮液，采用稀释法进行单孢分离纯化病原菌。待PDA平板上长出单菌落，用接种针挑取少量菌丝或孢子至新的PDA平板上培养，即获得单孢或单菌丝分离物。
　　1.2.3 致病性测定 病原菌孢子悬浮液的配制：将分离得到的病菌在PDA平板上培养7 d后，用0.025%的吐温80溶液和无菌水洗下孢子，用无菌的玻棒搅拌均匀，血球计数板观察计数。配制成浓度为 1×105 个·mL-1孢子悬浮液备用。
　　首先對美洲南瓜种子进行催芽处理然后移入育种盘，等幼苗生长7 d后在其根部和茎基部制造微伤口，在伤口处喷洒分离得到的浓度为1×105 个·mL-1的病菌孢子悬浮液后，在恒温培养箱中继续培养，温度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，以无菌水处理为对照，观察并记录[10]。待发病后取茎基部发病组织再次进行病原菌分离纯化与鉴定。
　　1.2.4 病原菌的形态学鉴定 将病原菌在PDA平板上纯化后用直径为5 mm打孔器打取菌饼，接种于新的PDA平板和CLA平板上，每种病原菌6次重复，然后置于25 ℃恒温培养箱培养。7 d后，观察记录培养于PDA平板上的病原菌菌落形态特征及培养皿背面着色情况。15 d后，挑取CLA平板上的菌丝在光学显微镜下观察其大、小型分生孢子等，并进行拍照。参照Leslie J.F等[11]的方法对病原菌进行鉴定。
　　1.2.5 病原菌的分子生物学鉴定 参照OMEGA公司的HP Plant DNA Kit试剂盒说明书提取病原菌DNA，利用真核生物基因组中的rDNA-ITS区段通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌基因组DNA 进行PCR扩增[12]。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送至西安擎科生物科技有限公司测序。将测序结果在NCBI网站的数据库中比对测序结果，在线搜索同源性较高的已知序列，将序列信息导入MEGA 7软件通过邻接法（neighbor-joining）构建系统聚类树，分析其亲缘关系。根据比对结果，进行分子生物学鉴定。
　　1.2.6 温度对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 将美洲南瓜枯萎病菌接种于PDA培养基上，分别置于 5、15、20、25、30、35、40 ℃无光照保湿培养7 d，每处理5次重复。用十字交叉法每2 d测量1次菌落的直径，取其平均值并计算菌丝平均生长速度。在培养7 d后，用无菌水洗下孢子制作成孢子悬浮液并将体积定容到10 mL，取50 μL孢子悬浮液滴于血球计数板上进行病原菌孢子计数[13]。
　　1.2.7 光照对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 将已接种美洲南瓜枯萎病菌的 PDA 培养基分为3组，25 ℃持续光照培养96 h;25 ℃持续黑暗培养96 h;25 ℃黑暗12 h与光照12 h交替培养96 h，每处理重复5次。按1.2.6中的方法测量菌丝生长和产孢量。
　　1.2.8 碳源对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 采用查彼（Czapek）培养基[14]作为基础培养基，将美洲南瓜枯萎病菌分别接入以相同质量的麦芽糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇和乳糖代替查彼培养基中的蔗糖的培养基中，并以不加碳源的培养基作为对照。室温培养，每处理5次重复。7 d后观察菌落形态和孢子形成情况并按照1.2.6中的方法测量菌丝生长和产孢量。
　　1.2.9 氮源对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 将美洲南瓜枯萎病菌分别接入以相同质量氮的硝酸铵、尿素、氯化铵、硫酸铵和牛肉浸膏替代替基础培养基中的NaNO3的培养基中，并以不加氮源的培养基为对照。室温培养，每处理5次重复。7 d后观察菌落形态和孢子形成情况并按照1.2.6中的方法测量菌丝生长和产孢量。
　　1.2.10 pH对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 将美洲南瓜枯萎病菌接种于不同pH的PDA培养基上，设置5个处理，pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每处理5次重复。在室温下培养，按1.2.6中的方法测量菌丝生长和产孢量。
　　2 结果与分析
　　2.1 美洲南瓜枯萎病田间发病症状
　　美洲南瓜枯萎病初期表现为植株下层叶片下垂或萎蔫，叶片颜色稍有加深，向主叶脉轻微皱缩，似缺水状（图1-b），病株茎基部维管束、茎秆表皮变褐腐烂（图1-c～d），出现初期症状后3～4 d植株死亡。
　　2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌的分离鉴定
　　2.2.1 病原菌的分离 在PDA培养基上对20株美洲南瓜病株全部进行分离与纯化，共得到16种分离物，根据形态学特征归为Ng-6、Ng-7 和Ng-8三个不同的类群，其中Ng-6包含3个分离物，占总分离物的18.75%;Ng-7包含11个分离物，占总分离物的68.75%;Ng-8包含2个分离物，占总分离物的12.5%。分别选取三个类群中最具代表性的Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1用于后续试验。
　　2.2.2 致病性测定 从2.2.1分离得到的 Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1进行纯化，分别用纯化后的菌株回接到美洲南瓜相同品种健康幼苗（图2），其中Ng-7-1的处理组美洲南瓜在7 d后发病且表现为叶片和茎秆萎蔫、失水，茎基部变褐，对照组均未发病且根系发达。根据柯赫氏法则，对接种病原菌后发病植株的病健交界处再次进行组织分离和纯化，得到的病原菌与Ng-7-1一致，故初次分离到的Ng-7-1为美洲南瓜枯萎病的致病菌。
　　2.2.3 病原菌的形态学鉴定 将纯化后的Ng-7-1菌株在PDA培养基上进行培养，在培养5～7 d 后可形成边缘较整齐的圆形单菌落。菌落正面为白色或紫色，突起絮状、绒毛状，菌丝体纤细，背面产生紫色色素（图3-a～b）;在CLA培养基上进行培养15 d后观察到病原菌菌株的分生孢子有两种形态，小型分生孢子数量居多呈椭圆形、卵形，多为单孢，大小为：（5.5～15.0×3.0～6.8） ?m（图3-c） ;大型分生孢子数量较少呈镰刀形，中间略弯曲，两端细胞稍尖，多数为3隔，大小为：（17.8～35.5×4.0～5.8）?m（图3-c）。根据菌落特征及病原菌分生孢子的形状，初步鉴定分离纯化的美洲南瓜枯萎病的病原为尖孢镰孢菌F. oxysporum。 　　2.2.4 分子生物学鉴定 将Ng-7-1菌株的ITS序列的测序结果提交至GenBank，获得注册号为MN814027。通过与NCBI网站的数据库进行比对分析，结果显示该序列与尖孢镰孢菌F. oxysporum的相似性达到了99%。建立系统发育树（图4），结果表明，Ng-7-1菌株与尖孢镰孢菌聚在同一分支，亲缘关系最近，从而确定从甘肃省武威地区采集的美洲南瓜枯萎病病株的病原菌为尖孢镰孢菌F. oxysporum。
　　2.3 溫度对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响
　　不同的温度对美洲南瓜枯萎病菌的菌株生长和产孢量具有一定的影响（表1），菌株在10～35 ℃范围内均能生长产孢，在20～30 ℃的温度范围内菌丝生长较好，其中生长最快，产孢量也最多的温度为25 ℃，该菌在温度低于5 ℃或高于40 ℃的条件下不生长也不产生分生孢子。
　　2.4 光照对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响
　　该菌在25 ℃条件培养24 h后进行不同光照处理后，菌丝生长和产孢量呈现出一定的差异（表2）。其中12 h光暗交替培养96 h的菌丝生长速率最快，产孢量最多，持续黑暗菌丝生长速率最慢。持续光照产孢量最少。
　　2.5 不同碳源对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响
　　该病原菌在不同的碳源培养基上均能生长，并且都与对照差异显著（表3）。其中最适碳源为淀粉，病原菌生长速率最快，产孢量最多，而该菌在葡萄糖培养基上生长速率最慢且产孢量最少。在对照培养基上菌丝几乎不生长。
　　2.6 不同氮源对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响
　　该病原菌在不同的氮源培养基上均能生长产孢，但不同氮源之间存在一定的差异（表4）。其中在硝酸钠和尿素培养基上菌丝生长速率较快且无显著性差异，在硫酸铵培养基上菌丝生长最慢。在牛肉浸膏培养基上产孢量最多，与其他氮源差异显著。在硫酸铵、尿素和硝酸铵培养基上产孢量较少且无明显差异。缺氮时菌丝生长较快但只是稀疏的气生菌丝，几乎不产孢。
　　2.7 pH对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响
　　该病原菌在pH为5.0～9.0范围内均能生长产孢（表5），其中pH为8.0时菌丝生长最快产孢量最多，而pH为5.0时菌丝生长速率最慢产孢量最少，说明该菌在中性及偏碱性条件下生长快，容易产孢。
　　3 讨 论
　　研究表明，瓜类、香蕉、茄子、向日葵等植物的枯萎病均由尖孢镰孢菌侵染所致[15-16]，该病菌具有不同的专化型[17]。据报道，引起瓜类枯萎病的致病菌至少存在8个专化型[18]，笔者对采集到的甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病进行病原菌的分离、纯化和鉴定，结合菌落形态特征、显微特征及ITS 分子鉴定结果对病原菌进行鉴定，确定引起甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病的病原为尖孢镰孢菌F. oxysporum。
　　病原菌的生物学特性研究是病原菌的基础研究，尤其为抗病育种和生物防治研究提供理论依据，本研究结果表明该菌在10～35 ℃范围内均能生长产孢，25 ℃为最适生长温度。菌丝生长最佳的光照条件为12 h光暗交替，最适碳源为淀粉。这与沈文渊[19]报道的尖孢镰孢菌黄瓜专化型、尖孢镰孢菌冬瓜专化型、尖孢镰孢菌西瓜专化型、尖孢镰孢菌苦瓜专化型的最适温度，光照和碳源的研究结果相似。根据肖昌华等[20]的报道，苦瓜枯萎病病原菌的生长最适pH为6.3，产孢最适pH为6.3～8.5，而本试验中病原菌菌丝生长及产孢最适pH为8，分析原因可能是因为不同的专化型菌对生长所需的酸碱度不同以及病原菌分离地的土壤酸碱度有关，但在总体上来看尖孢镰孢菌适合在中性及偏碱性条件下生长。在沈文渊[19]的报道中4种尖孢镰孢菌专化型的最适氮源都为蛋白胨，而本试验中病原菌生产速率最好的氮源为硝酸钠和尿素，产孢量最多的是牛肉浸膏。分析原因可能是因为不同专化型菌之间存在着对氮源的利用有一定的差异。同时说明该菌在菌丝的生长和产孢过程中不同的氮源起着不同的作用。
　　笔者鉴定了甘肃省武威地区美洲南瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰孢菌F. oxysporum，并对其生物学特性进行了测定，但美洲南瓜枯萎病病原菌是否存在专化型，以及该病原菌的传播途径等问题有待于进一步研究。
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