黄曲霉毒素B1降解菌的筛选与鉴定

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　　摘要：
　　黄曲霉毒素B1主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其具有极高的致突变性、毒性和致癌性。黄曲霉毒素污染广泛存在于奶制品、饲料等行业中。本研究以香豆素为碳源，筛选出1株降解率为8277%的黄曲霉毒素B1降解菌，经生理生化试验初步鉴定属于芽孢杆菌属。
　　关键词：
　　黄曲霉毒素B1;降解菌;筛选;鉴定
　　中图分类号：S-3
　　文献标识码：A
　　DOI：1019754/jnyyjs20200630006
　　
　　黄曲霉毒素（Aflatoxin）主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其具有极高的致突变性、毒性和致癌性[1]。在所有黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最强。AFB1具有二呋喃香豆素衍生物一组相关结构，其结构与香豆素十分相似。
　　黄曲霉毒素污染广泛存在于奶制品、饲料等行业中，玉米饲料原料中的AFB1不仅影响牲畜健康[2]，还会在奶牛体内转变为AFM1，从而污染奶制品。2011年12月24日，国家质检总局抽查发现蒙牛乳业（眉山）的盒装鲜奶黄曲霉毒素M1超标达140%[3]。目前去除AFB1的物理方法包括烘烤、吸附剂、紫外线照射、电离辐射等，化学方法主要有碱法、氧化法等[4]。但这些方法存在营养损失、质量下降、设备成本高等缺点，限制了其实际应用效果。利用微生物或其代谢物将AFB1降解和解毒，具有诸多优点。目前已经发现有几种微生物能够将AFB1转化为毒性较小的代谢物，如平菇、花叶菌、根霉、毛霉、酿酒酵母、木霉、乳酸杆菌、丙酸杆菌[5，6]，但尚无实际应用报道。
　　本研究以香豆素为唯一碳源对AFB1降解菌进行初筛，复筛使用HPLC法测定降解菌的AFB1降解率，并进行初步的生理生化鉴定，以期为今后AFB1的降解研究及其在饲料业与奶制品业中的应用奠定基础。
　　1材料与方法
　　11材料
　　111土壤样品
　　土壤样品取自吉林市猴石山与吉林农业科技学院。
　　112培养基
　　种子培养基：NaCl05%、蛋白胨1%、牛肉膏03%，pH70。
　　初筛培养基：KH2PO40025%、香豆素05%、CaCl201%、NH4NO301%、FeSO401%、MgSO40025%、琼脂15%，pH70。
　　发酵培养基：蛋白胨1%、牛肉膏03%、葡萄糖02%、KH2PO401%、NaCl0085%，pH70。
　　NB培养基：蛋白胨1%、酵母膏5%、NaCl1%、琼脂2%、水1000mL，pH70。
　　113试剂
　　牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、龙胆紫、氯霉素、香豆素等为国产分析纯;AFB1标准品，美国Sigma生产;生理生化鉴定试剂盒，青岛海博生物生产。
　　12仪器与设备
　　YM50AI全自动灭菌锅（诸诚市中耀机械有限公司）;SW-CJ-1FD超净工作台（苏洁医疗器械（苏州）有限公司）;恒温培养箱Termaks series KB8000（常州首创仪器设备有限公司）;SC-15A恒温水浴锅（杰瑞安仪器设备有限公司）。
　　13实验方法
　　131降解菌初筛
　　称量1g土样，置于50mL生理盐水中，160r/min、30℃下，摇床培养72h。培养结束后静置20min，吸取1mL上清液用无菌蒸馏水稀释置10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。稀释后的样品吸取03mL均匀涂布于初筛培养基上，在37℃中培养3～7d后，挑取单菌落于NB培养基平板中培养。
　　132降解菌复筛
　　初筛得到的菌株在NB液体培养基中37℃培养1d。以5%接种量接种于发酵培养基，37℃下，培养2d。取980μL发酵液和20μLAFB1标准品（100g/mL）混匀，20μLAFB1标准产品为空白对照，同时设置2组平行实验，37℃，150r/min培养3d后，12000r/min，5min离心，取上清液待测。
　　133HPLC检测AFB1降解率
　　AFB1的提取和含量检测方法参照GB 500922—2016。涡流振荡30s，共3次。移取二氯甲烷层，在36℃氮吹仪下干燥后，溶于1mL的乙腈，使用022μm微孔滤膜过滤。
　　色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（150mm×46mm，5μm）;流动相为甲醇∶水=1∶1（V∶V），流速09mL/min;柱温30℃，运行时间30min，检测波长为365nm。AFB1的降解率用以下公式进行计算。
　　AFB1降解率（%）=（1-实验组AFB1含量/对照组AFB1含量）×100%
　　134形态学鉴定
　　肉眼观察菌落形态并使用革兰氏染色法[7]进行鉴定。
　　135生理生化鉴定
　　使用生理生化鉴定试剂盒分别进行V-P测定试验、明胶液化试验、O/F试验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐利用试验、甲基红试验、硫化氢试验与糖酵解试验[8]。
　　2结果与分析
　　21菌种的初筛结果
　　将香豆素作为唯一碳源的培养基，通过初步筛选，得到10株能够稳定降解的菌株。对采集得到的不同土樣分析得知，其中6株来自于猴石山采取的土样，4株来自于吉林农业科技学院校园里采取的土样。 　　22菌种的复筛结果
　　将初筛得到的10株菌株进行复筛，进行降解率测定。如表1所示，有3株降解菌（LQ-HT1、LQ-HT3、LQ-HT4）的降解率达到70%以上，其中1株降解菌（LQ-HT3）的降解率最高为8277%，分析菌种的来源可知，野生环境下的土壤更容易筛选得到降解率较高的菌株。
　　23AFB1降解菌株的鉴定
　　菌落形态如图1所示，该降解菌在LB培养基上的形态呈圆形、潮湿，具有粘性，带有光泽;如图2所示，细胞形态为杆状，有芽孢，革兰氏阳性菌。
　　24AFB1降解菌的生理生化鉴定
　　生理生化鉴定试验结果表明，细菌革兰氏染色结果为阳性菌，可以利用柠檬酸和丙酸，符合大多数芽孢杆菌的特征[9]，结合其它生理生化指标（表2），判断LQ-HT3属于芽孢杆菌属。
　　3结论
　　本研究筛选得到1株可降解AFB1的菌株LQ-HT3，降解率为8277%。形态学与生理生化鉴定试验结果表明其属于芽孢杆菌属。应用本研究成果，可以对AFB1降解菌进行分子生物学鉴定，优化发酵条件，提高其AFB1降解能力，以期早日应用于奶制品与饲料行业中。
　　参考文献
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　　Diaz， D.E. The mycotoxin blue book[M]. England：Nottingham University， 2005.
　　[2] Motomura M ， Toyomasu T ， Mizuno K ， et al. Purification and characterization of an aflatoxin degradation enzyme from Pleurotus ostreatus[J]. International Journal of Food Microbiology， 2003（158）：237-242.
　　[3]郭立場.黄曲霉毒素会不会成为压垮蒙牛的最后一根稻草[J].广西质量监督导报，2012（01）：14.
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　　[5] János Varga， Zsanett Péteri， Katalin Tábori， et al. Degradation of ochratoxin A and other mycotoxins by Rhizopus isolates[J]. International Journal of Food Microbiology， 2005， 99（03）：321-328.
　　[6] Molnar O ， Schatzmayr G ，Fuchs E ， et al. Trichosporon mycotoxinivorans sp. nov. A New Yeast Species Useful in Biological Detoxification of Various Mycotoxins[J]. Systematic & Applied Microbiology， 2004， 27（06）：661-671.
　　[7] Shetty P H ， Jespersen L . Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria as potential mycotoxin decontaminating agents[J]. Trends in Food Science & Technology， 2005， 17（02）：48-55.
　　[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
　　[9]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰氏细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984.
　　（责任编辑李媛媛）
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