一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
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作者:姚凌妍 沈建华
摘 要：分离筛选耐盐的蛋白酶高产菌并加以鉴定。从厨余垃圾存放处土壤中分离细菌，利用蛋白水解透明圈初筛蛋白酶高产菌，并进行蛋白酶高产菌的耐盐试验，对所得的耐盐蛋白酶高产菌进行革兰氏染色与半固体穿刺培养。从土壤中分离得到19个单菌落，在初筛培养基上点种接种，有4株有比较明显的水解透明圈，其中P2，P3为蛋白酶高产菌，耐盐试验表明P3最适盐浓度为2%，为耐盐高产菌株。P3革兰染色阳性，杆状，产芽孢，好氧，有鞭毛。从厨余垃圾存放处的土壤中分离得到一株耐盐的蛋白酶高产菌P3，为高渗条件下发酵生产蛋白酶提供了一种可能的菌种。
关键词：蛋白酶 耐盐 初筛 鉴定
碱性蛋白酶、α-淀粉酶及糖化酶是三大工业酶制剂，其总产量约占酶类制剂的80%以上。催化蛋白质水解的酶称为蛋白酶，其中碱性条件下能水解蛋白质中肽键的酶即碱性蛋白酶，其最适pH在9～11范围内，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。因此，蛋白酶的生产在酶制剂乃至整个生物技术产业中占有重要的地位。蛋白酶广泛分布于动物、植物与微生物中。由于植物受生长地域、季节、气候等的影响，生产酶制剂的产量、质量都不稳定。动物产生的酶主要从屠宰牲畜的腺体中提取，来源有限。只有微生物生产的酶，可满足任何规模的需求，产率高、质量稳定。同时，微生物产生的蛋白酶通常为胞外酶，分泌到发酵液中，相较于动植物来源的蛋白酶，分离纯化的难度大大降低。工业上规模化培养微生物时，出于提高产率的考量，一般培养液的浓度尽量提高，这就要求发酵菌种能够耐受较高的渗透压，往往使用耐高盐的菌种。耐盐的蛋白酶高产菌菌种的选育成为蛋白酶生产的关键。
本文拟从土壤中分离细菌，筛选出耐盐的蛋白酶高产菌，并进行初步鉴定，以期为蛋白酶生产提供可能的细菌菌株。
1 材料与方法
1.1 土壤样品稀释液
从南京科技职业学院校园内厨余垃圾存放处土地采集土样，五点取样，取表层以下5～10cm处的土样，混匀，放入无菌的袋中备用。实验时称土样1g，迅速倒入带玻璃珠的99mL无菌水瓶中振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。用无菌移液管吸10-2的土壤悬液1mL，放入9mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液[1]。
1.2 土壤细菌的分离
1.2.1 营养琼脂培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，加水至1000mL，调pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
1.2.2 土壤稀释液平板浇注
取1mL土壤稀释液接种至无菌培养皿，待培养基降温至50℃趁热倒平板，混匀，待平板凝固后，倒置，37℃恒温培养箱培养24h，获得细菌菌落。
1.2.3 分离培养基
牛肉膏2g，琼脂15g，加水至800mL，121℃灭菌20min，脱脂牛奶200mL单独灭菌，105℃，20min，各自灭菌后趁热混合，自然pH。倒入无菌培养皿，即得划线分离平板[2]。
1.2.4 平板划线分离
从混匀浇注的平板上挑取单菌落，在无菌平板上进行三区划线分离，获得纯种。
1.3 蛋白酶产生菌的初筛
1.3.1 初筛培养基
脱脂奶粉10g，琼脂10g，加水至1000mL，0.06MPa，115℃高压灭菌10min。趁热倒平板。
1.3.2 平板透明圈法初筛
将划线分离得到的纯种分别点种于初筛培养基上，每个平板点种2个菌株，倒置，37℃恒温培养箱培养24h，测量所接菌株的水解圈的直径（Dh）与菌落的直径（Dc）。根据Dh与Dc的比值，确定各个菌株产蛋白酶能力的强弱，从而筛选出蛋白酶高产菌[3]，见表1。
1.4 蛋白酶高产菌的耐盐试验
1.4.1 耐盐试验培养基
肉汤培养基中分别添加0%～9%（w/v）不等的氯化钠，调pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
1.4.2 耐盐试验
取初筛培养基上水解透明圈明显的菌落，用接种环刮取一环，接入50mL肉汤培养基中，25℃恒温摇床150r/min震荡培养18h至OD600为0.5作为种子液。在100mL不同氯化钠浓度的肉汤培养基中分别准确接入1mL种子液，25℃恒温摇床150r/min震荡培养18h，测定OD600[4]。
1.5 耐盐蛋白酶高产菌的初步鉴定
1.5.1 革兰氏染色
用革兰氏染色试剂盒进行革兰氏染色，观察细菌形态。
1.5.2 半固體穿刺培养
用接种针挑取耐盐蛋白酶高产菌，在半固体培养基上穿刺接种，考察其有无鞭毛及需氧情况。
2 结果与讨论
2.1 土壤细菌分离与纯化结果
从南京科技职业学院校内厨余垃圾存放处土壤样品中，稀释倒平板并在分离培养基上划线分离得到19个菌落，依次编号。
2.2 蛋白酶产生菌初筛结果
19个单菌落点种于初筛培养基上，有4个能够产生比较明显的透明圈，4个菌株的Dh、Dc以及Dh/Dc见表1。比较不同菌株的Dh/Dc可知，P2与P3的Dh/Dc都在3以上，可初步判定为蛋白酶高产菌。
2.3 耐盐试验结果
蛋白酶高产菌P2与P3的耐盐试验结果见图1。由图可知蛋白酶高产菌P2能在含0%～6%氯化钠的肉汤培养基中生长，最适盐浓度为1%;而蛋白酶高产菌P3能在含0%～7%氯化钠的肉汤培养基中生长，其最适盐浓度为2%，且每个盐浓度下，P3的光密度值都高于P2。因此，菌株P3是耐盐的蛋白酶高产菌。 2.4 P3菌的初步鑒定
2.4.1 革兰氏染色结果
P3菌株的革兰氏染色结果见图2。由图可知，P3菌革兰氏染色结果呈阳性，杆状，产芽孢。
2.4.2 半固体培养结果
P3菌株半固体培养，在培养基表面及穿刺线上部生长，表明该菌为好氧菌，且从穿刺线向四周扩散生长，表明其具有鞭毛，能运动。
3 结语
本文从南京科技职业学院存放厨余垃圾处的土壤中稀释倒平板并划线分离得到19个菌落，将分离得到的单菌落点种于初筛培养基上，得到4株水解透明圈较明显的菌株P1、P2、P3以及P4，其中P2与P3的Dh/Dc值在3以上，初步判定为蛋白酶高产菌。再对P2以及P3进行耐盐试验，发现P3菌株能在含0%～7%氯化钠的肉汤培养基中生长，且最适盐浓度为2%，远高于普通肉汤培养基中的0.5%的盐浓度，具备耐盐特性，因此P3菌具备耐高盐蛋白酶高产菌的潜质。针对P3菌进行了初步的鉴定，革兰染色阳性，杆状，产芽孢，半固体穿刺培养试验表明其具有鞭毛，好氧。P3菌是从厨余垃圾存放处的土壤中分离得到的。由于其生存环境中存在丰富的蛋白质来源以及具备较高的盐浓度的条件，所以易于分离得到耐盐的蛋白酶高产菌。当然，P3菌的蛋白酶产生能力还需要进行复筛，并进行发酵液的酶活力测定，这是笔者下一步准备进行的工作。另外，本文只对P3菌进行了初步的鉴定，目前已知其形态特征为革兰阳性，杆菌，产芽孢，好氧，有鞭毛能运动。后续还要通过一系列生理生化试验，测定16S rRNA的基因序列，以及作P3菌的系统发育分析，才能确证其为何种属的细菌。
总之，本文从厨余垃圾存放处的土壤中分离得到一株耐盐的蛋白酶高产菌P3，并初步进行了形态学观察和半固体穿刺培养，为高渗条件下发酵生产蛋白酶提供了一种可能的菌种。
参考文献
[1] 刘国生.微生物学实验技术[M].北京：科学出版社，2007.
[2] 代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛大学，2008.
[3] 王永红.产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及水解菜粕蛋白能力[J].生物资源，2018，40（2）：135-140.
[4] 马桂珍.高产蛋白酶细菌的分离筛选及其种类鉴定[J].食品科学，2011，32（21）：183-187.
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